体内DNA甲基化编辑技术的建立及其在基因功能研究和疾病治疗中的应用

《Nature Communications》：Editing DNA methylation in vivo

本研究针对体内DNA甲基化编辑技术缺乏的难题，开发了可诱导的dCas9-DNMT3A/dCas9-TET1转基因小鼠模型。通过在肝脏靶向甲基化Pcsk9基因启动子成功降低血清LDL胆固醇水平，及通过靶向去甲基化Mecp2启动子挽救神经元异常，证实了该技术在表观遗传调控和治疗应用中的潜力。全基因组分析显示该系统具有高度特异性，为功能解析DNA甲基化提供了重要工具。

　　

在生命科学的广阔图景中，表观遗传学（epigenetics）犹如一把精巧的钥匙，调控着基因的表达而不改变DNA序列本身。DNA甲基化（DNA methylation）是其中最为重要的机制之一，它像基因上的“开关”，能决定基因的“开启”或“关闭”。科学家们一直渴望能够精确地编辑这些甲基化标记，从而深入理解它们在发育、疾病中的具体功能。然而，尽管体外细胞实验取得了长足进步，如何在活体动物体内实现精准、可控的DNA甲基化编辑，始终是一个巨大的挑战。递送效率、编辑特异性以及体内环境的复杂性，如同几座大山，阻碍着研究人员探索体内表观遗传世界的脚步。正是为了翻越这些大山，一项发表于《Nature Communications》的研究应运而生。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了几个关键技术方法：他们首先构建了两种转基因小鼠模型，分别携带可诱导表达的dCas9-DNMT3A（催化失活的Cas9与DNA甲基转移酶3A的融合蛋白）和dCas9-TET1（催化失活的Cas9与Ten-eleven translocation甲基胞嘧啶双加氧酶1的融合蛋白）编辑器。通过向导RNA（gRNA）的引导，在活体小鼠的特定组织（如肝脏、大脑）中实现对目标基因启动子区域的特异性甲基化或去甲基化。利用深度亚硫酸氢盐测序等方法评估编辑效率，并通过RNA测序、血清生化分析、组织学检查等手段评估其生物学效应和脱靶情况。

靶向DNA甲基化编辑系统的体内验证

研究人员成功建立了两种转基因小鼠品系，分别表达可诱导的dCas9-DNMT3A（用于增加甲基化）和dCas9-TET1（用于减少甲基化）融合蛋白。通过在小鼠肝脏中靶向Pcsk9基因的启动子区域，他们证实dCas9-DNMT3A系统能够有效介导该区域的特异性甲基化。与此相应，他们观察到肝脏中Pcsk9基因的mRNA和蛋白表达水平均显著下降。这一结果在体内验证了该编辑系统能够依据引导精确地执行甲基化编辑功能，并成功调控下游靶基因的表达。

Pcsk9甲基化编辑降低血清胆固醇水平

为了探究上述表观遗传编辑的生理学意义，研究人员测量了经过靶向甲基化编辑的小鼠的血清脂质水平。他们发现，与对照组相比，肝脏特异性Pcsk9启动子甲基化导致了血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平的显著降低。这一发现具有重要的潜在治疗价值，因为PCSK9是已知的胆固醇代谢关键调节因子，其抑制剂已被用于临床治疗高胆固醇血症。该结果表明，通过表观遗传编辑调控Pcsk9表达，可能成为管理血脂异常和相关心血管疾病的一种新策略。

Mecp2靶向去甲基化挽救疾病表型

研究团队进一步将dCas9-TET1系统应用于Rett综合征的相关研究。Rett综合征是一种主要由MECP2基因突变引起的神经发育障碍。在雌性Mecp2^+/-小鼠（模拟Rett综合征的模型）中，一个Mecp2等位基因失活。研究人员通过颅内注射gRNA病毒载体，靶向编辑大脑中失活X染色体上的Mecp2基因启动子，成功实现了该区域的去甲基化。令人振奋的是，这一操作重新激活了来自原本沉默的X染色体上的Mecp2基因的表达。更重要的是，这种表观遗传干预挽救了小鼠模型中的神经元核缩小表型，这是Rett综合征的一个典型细胞特征。这为探索通过表观遗传编辑治疗由MECP2功能障碍引起的神经系统疾病提供了概念验证。

基因组水平评估编辑特异性

确保基因编辑工具的安全性至关重要。为了评估dCas9表观遗传编辑系统的脱靶效应，研究人员进行了全基因组RNA测序（RNA-seq）分析。他们将经过编辑的小鼠与对照组小鼠的转录组进行比较，结果发现，除了预期的靶基因表达变化外，全基因组范围内并未检测到显著的转录组扰动。这表明dCas9-DNMT3A和dCas9-TET1系统在体内具有高度的特异性，其脱靶效应极低，为该技术的进一步应用和潜在临床转化提供了重要的安全性数据支持。

综上所述，这项研究成功地开发并验证了两种能够在活体动物体内进行组织特异性、可诱导DNA甲基化编辑的转基因小鼠模型。研究结论明确指出，利用dCas9-DNMT3A系统靶向甲基化肝脏中的Pcsk9启动子，能够有效降低血清LDL-C水平；而利用dCas9-TET1系统靶向去甲基化大脑中的Mecp2启动子，则可以挽救Rett综合征小鼠模型的神经元异常。讨论部分强调，全基因组分析证实了该编辑系统的高特异性，脱靶效应极低。这项工作的意义重大，它不仅提供了一套强大的功能基因组学研究工具，用于在生理背景下直接论证特定DNA甲基化事件的功能，更重要的是，它展示了表观遗传编辑在治疗由表观遗传失调引起的疾病，如代谢性疾病和神经发育障碍方面的巨大潜力，为开发新的治疗模式开辟了道路。