流感血凝素原发性奥司他韦耐药突变K130N/E的发现及其对抗病毒耐药监测的启示

《Nature Communications》：A primary oseltamivir-resistant mutation in influenza hemagglutinin and its implications for antiviral resistance surveillance

本研究针对流感病毒在奥司他韦压力下可能通过血凝素(HA)突变产生耐药性的科学问题，通过体外传代实验首次证实A(H1N1)pdm09病毒可独立获得HA-K130N/E原发性奥司他韦耐药突变。研究发现该突变通过改变受体结合特性降低对神经氨酸酶抑制剂(NAIs)的敏感性，且与NA-N295S突变具有协同增效作用，揭示了当前流行株中HA-K130N突变率上升的潜在临床意义，为完善流感抗病毒耐药监测体系提供了关键证据。

　　

当全球公共卫生系统每年严阵以待应对季节性流感侵袭时，奥司他韦作为最广泛使用的神经氨酸酶抑制剂(NAI)，始终是抵抗流感病毒的重要防线。然而，病毒通过不断进化产生的耐药性，正在悄然侵蚀这道防线的稳固性。传统认知中，奥司他韦耐药性主要源于神经氨酸酶(NA)蛋白的突变，但中国科学院微生物研究所邓涛教授团队在《Nature Communications》发表的最新研究，揭示了一个颠覆性的发现：流感病毒的血凝素(HA)蛋白同样能够产生原发性奥司他韦耐药突变，且这种突变正在全球流行株中迅速扩散。

流感病毒的表面镶嵌着两种关键糖蛋白——血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA负责识别宿主细胞表面的唾液酸(SA)受体并介导病毒入侵，而NA则通过切割唾液酸促进子代病毒释放。这两种功能必须保持精细平衡，任何一方的功能失调都会影响病毒感染效率。奥司他韦通过模拟唾液酸结构与NA活性位点结合，抑制其酶活功能，从而阻断病毒释放。当NA发生H275Y、R293K或N295S等突变时，会降低奥司他韦的结合能力，产生耐药性。但这类突变往往伴随病毒适应性代价，需要通过次级"许可性"突变来补偿。

值得注意的是，在免疫功能低下患者中，延长抗病毒治疗可能导致病毒进化出更复杂的耐药机制。为模拟这一过程，研究人员设计了精密的体外实验方案：将A/California/07/2009 (H1N1)pdm09病毒在递增浓度的奥司他韦压力下进行连续传代，同时设置先使用法匹拉韦（favipiravir）处理增强病毒突变率再施加奥司他韦压力的实验组。通过噬斑减少实验、病毒基因组测序、反向遗传学拯救重组病毒、表面等离子共振(SPR)技术、神经氨酸酶抑制实验、血凝-洗脱实验(HAE)以及竞争性共感染实验等多种技术方法，系统阐明了HA突变介导的耐药机制。研究还分析了全球共享所有流感数据倡议(GISAID)数据库中2015-2024年的H1亚型病毒序列，并检测了近期分离的临床毒株。

筛选A(H1N1)pdm09病毒中的奥司他韦耐药突变

研究人员发现，经过7代奥司他韦压力传代后，病毒群体出现了HA-K130E突变(出现率100%)和NA-N21S突变(出现率66.6%)。而在先用法匹拉韦后奥司他韦处理的病毒群体中，主要出现HA-K130N突变(出现率83.3%)，同时伴有HA-K142N和已知的耐药突变NA-N295S、NA-R293K。这些结果表明，在抗病毒压力下，HA基因能够独立产生耐药突变。

HA-K130N和HA-K130E突变赋予奥司他韦耐药性

通过反向遗传学拯救的重组病毒验证发现，HA-K130N和HA-K130E均能独立 confer oseltamivir resistance。在噬斑减少实验中，野生型病毒在0.01μM奥司他韦下即受抑制，而HA-K130N突变体在1μM才被显著抑制，HA-K130E突变体甚至在100μM时仍能形成较大噬斑。值得注意的是，在0.33μM这一临床相关血药浓度下，HA-K130N突变体保持了较高的复制适应性。

HA-K130N和HA-K130E突变导致对多种神经氨酸酶抑制剂的交叉耐药

这两种HA突变不仅对奥司他韦产生耐药，对扎那米韦(zanamivir)和帕拉米韦(peramivir)也表现出交叉耐药性。然而，传统的神经氨酸酶抑制实验却无法检测到这种由HA突变介导的耐药性，因为其IC₅₀值与野生型病毒相当，这揭示了当前耐药监测体系的盲点。

HA-K130N和HA-K130E突变影响受体结合亲和力

结构分析显示，HA-K130位于受体结合位点(RBS)的130环区，紧邻唾液酸结合位点。将带正电的赖氨酸(K)替换为天冬酰胺(N)或谷氨酸(E)后，RBS的电荷性质发生改变，从而降低了对人类α-2,6唾液酸受体的结合亲和力。这种结合亲和力的降低，重新平衡了被奥司他韦破坏的HA-NA功能平衡，使病毒在NA活性受抑制的情况下仍能有效释放。

HA-K130N自2019年起在全球流行H1毒株中逐渐占据主导地位

对GISAID数据库的分析揭示了一个令人警觉的趋势：2019年前，HA-130K是绝对优势氨基酸；但2019年后，HA-130N突变频率急剧上升，到2024年已成为人类H1毒株中的主导基因型。系统进化分析表明，HA-K130N与当前流行的进化枝6B.1A.5a.2a.1密切相关，提示该突变在人类宿主中具有适应性优势。

HA-K130N与NA-N295S协同增强奥司他韦耐药性

研究发现，HA-K130N与已知的NA耐药突变NA-N295S存在协同效应。单独突变仅产生中等程度耐药，但两者组合后，病毒即使在10μM奥司他韦下仍能形成较大噬斑，耐药性显著增强。尽管目前携带HA-K130N的临床分离株仍对奥司他韦敏感，可能由于HA或NA中的补偿性突变抵消了耐药表型，但这一协同机制的发现为未来耐药株的出现敲响了警钟。

该研究首次提供了HA蛋白可独立产生原发性奥司他韦耐药突变的实验证据，揭示了流感病毒耐药进化的新途径。HA-K130N在流行株中的快速扩散以及其与NA耐药突变的协同效应，对全球流感防控策略提出了新的挑战。研究结果强烈提示，当前的耐药监测体系必须从单纯关注NA基因扩展到同时监测HA基因突变，特别是在奥司他韦广泛使用的背景下。对于免疫低下等易产生耐药突变的高危人群，应考虑更精准的抗病毒策略，以防耐药株的产生和传播。这项研究不仅深化了对流感病毒耐药机制的理解，也为完善全球流感耐药监测网络提供了关键科学依据。