活细胞与合成细胞自组装构建三维杂化肿瘤模型及其在肿瘤免疫微环境研究中的应用

《Nature Communications》：Self-assembly of hybrid 3D cultures by integrating living and synthetic cells

本研究针对传统三维肿瘤模型难以稳定整合肿瘤微环境(TME)中异质性细胞（如免疫细胞）的挑战，开发了一种通过活细胞与合成细胞共自组装构建杂化三维肿瘤类器官(hybrid tumoroids)的新策略。研究人员筛选了多种合成细胞模型，发现基于液滴支撑脂质双层(DSLB)的合成细胞能稳定整合至胰腺导管腺癌(PDAC)肿瘤类器官中，形成人工肿瘤免疫微环境(ART-TIME)。通过在该微环境中系统展示免疫受体配体，揭示了PD-1与CD2共信号通过AhR-ARNT通路驱动免疫逃避的新机制。该研究为合成生物学与肿瘤免疫研究提供了创新平台。

　　

在癌症研究领域，三维肿瘤模型如肿瘤类器官(tumoroids)和器官样体(organoids)因其能更好地模拟体内肿瘤的复杂结构和功能，已成为替代二维细胞培养和动物模型的重要工具。这些模型能够重现细胞外基质网络、空腔形成、组织不对称性以及代谢梯度等关键特征。然而，一个长期存在的挑战是如何在三维模型中稳定地整合肿瘤微环境中的其他细胞类型，如成纤维细胞、神经元，尤其是免疫细胞。这些细胞在体内与癌细胞动态相互作用，深刻影响肿瘤的生长和治疗反应，但在自组装的三维模型中，它们往往难以长期共存，甚至会被癌细胞主动排斥。

为了突破这一瓶颈，来自德国莱布尼茨新材料研究所等机构的研究团队另辟蹊径，尝试用合成细胞(synthetic cells)这种仿生材料来模拟和替代肿瘤微环境中的天然细胞成分。合成细胞是人工构建的简化细胞模型，能够模拟天然细胞的特定生物物理和生化特性，如细胞膜结构、分子拥挤环境或生物力学特性。如果能够将合成细胞与活细胞在三维空间中稳定整合，将有望构建出既能模拟复杂细胞间相互作用，又具有高度可控性的新型杂交模型。

在这项发表于《Nature Communications》的最新研究中，研究人员成功实现了这一构想。他们报道了一种通过活细胞与合成细胞共自组装构建三维杂化肿瘤培养物的新方法，并利用该平台揭示了胰腺癌免疫逃避的新机制。

研究人员为开展此项研究，主要运用了以下几项关键技术：他们筛选了多种合成细胞模型（包括巨型单层囊泡GUVs、聚合物凝聚体、无机二氧化硅胶体小体、液滴支撑脂质双层DSLBs和蛋白质小体）与多种癌细胞系（如Panc-1、BT-747等）进行共培养；利用共聚焦显微镜、透射电子显微镜和活细胞成像技术观察杂交肿瘤体的形成过程和细胞界面；通过RNA测序(RNAseq)、差异基因表达分析(DEG)、通路富集分析和基因调控网络分析来解析合成细胞表面表达的免疫受体配体（如PD-1、CD2等）对癌细胞转录组的影响；采用磷酸化激酶阵列(Proteome Profiler)检测关键信号蛋白的磷酸化水平；并利用从健康献血者白细胞分离系统(LRS)中分离的原代人CD8⁺T细胞，通过流式细胞术、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验和自动化ELLA免疫分析等方法，评估杂交肿瘤体对T细胞活化和细胞毒功能的影响。此外，研究还利用了癌症基因组图谱(TCGA)和基因型-组织表达(GTEx)数据库的临床数据进行了生存分析。

集成合成细胞到肿瘤类器官中的自组装

研究团队首先筛选了五种癌细胞系（BT-747, MCF-7, Capan-1, Capan-2 和 Panc-1）形成肿瘤类器官的能力，并选择了Panc-1和BT-747这两种能形成最致密类器官的细胞系进行后续实验。随后，他们制备了五种常用的合成细胞模型（GUVs、聚合物凝聚体、二氧化硅胶体小体、DSLBs和蛋白质小体），并将它们与分散的Panc-1细胞共培养。结果发现，胶体小体和DSLBs能够完全整合到自组装形成的肿瘤类器官中，而GUVs和蛋白质小体则表现出较强的附着和部分整合。凝聚体微滴则完全不能整合。量化分析显示，在Panc-1和Capan-1肿瘤类器官中整合率最高，合成细胞与天然细胞的比例可达1:22至1:8。增加合成细胞的比例会导致整合数量的相应增加，表明整合过程是随机且稳健的。重要的是，胶体小体和DSLBs在肿瘤类器官内可以稳定存留长达7天，组织学分析也证实它们被嵌入到多细胞结构中，与癌细胞直接接触。

杂交肿瘤类器官组装的机制及合成-天然细胞界面

为了探究整合机制，研究人员通过活细胞成像观察到，癌细胞在形成细胞间粘附的同时，也会粘附到合成细胞上，并将其拉入正在发育的肿瘤类器官中。将合成细胞添加到预形成的肿瘤类器官中则整合有限，表明粘附是整合的关键。共聚焦显微镜和透射电镜分析揭示了天然细胞通过富含肌动蛋白的丝状伪足样突起与合成细胞形成紧密的膜-膜相互作用界面。合成细胞表面发生了显著的血清蛋白调理作用(opsonization)，其程度与整合效率正相关。研究人员假设杂交肿瘤类器官的形成受细胞间粘附（如E-钙黏蛋白）和细胞外粘附（如整合素）之间的平衡调控。表达更多整合素（即更依赖细胞外粘附）的细胞系整合了更多的合成细胞。此外，合成细胞表面的界面张力也至关重要，整合成功的合成细胞模型具有较高的界面张力（3-50 mN/m），而整合失败的凝聚体界面张力极低（10-500 μN/m）。一旦整合，天然细胞会持续对具有类似天然细胞刚度（~1 kPa）的DSLBs施加力，导致其发生形变，甚至观察到类似胞啃作用(trogocytosis)的膜成分交换。

研究人员进一步展示了界面的特异性生物功能化。他们将重组组氨酸标签标记的CD40L胞外域通过NTA(Ni²⁺)螯合化学耦联到DSLB表面，并整合到Panc-1肿瘤类器官中。免疫染色显示，癌细胞内的CD40受体在合成细胞接触界面处富集，qPCR和蛋白质印迹证实了CD40下游抗凋亡蛋白Bfl-1的表达上调，而可溶性CD40L则无此效果，证明了合成细胞能引发特异性的受体-配体信号传导。

人工肿瘤免疫微环境用于研究三维空间中的受体共信号传导

在成功构建杂交模型的基础上，研究团队创建了人工肿瘤免疫微环境(ART-TIME)，用功能化的合成细胞模拟肿瘤浸润淋巴细胞。他们筛选了7种免疫受体配体（CD2、CD27、CD40L、CTLA-4、LAG3、ICOS、TIGIT），将它们单独或与PD-1共同呈现在DSLB表面，并与Panc-1细胞自组装成ART-TIME。通过RNA测序和差异表达基因分析发现，PD-1与CD2、CTLA-4或CD27共呈现时，能诱导大量差异表达基因，其中PD-1/CD2组合效果最显著。通路富集分析显示，p53和芳香烃受体(AhR)信号通路相关基因被特异性调控。基因调控网络分析确定了MAPK1、PRKCA、PRKACA、p53和ARNT五个核心信号节点。磷酸化激酶阵列分析证实了这些信号蛋白的磷酸化水平在PD-1/CD2 ART-TIME中存在协同、叠加或悖论性变化。

功能实验表明，用PD-1/CD2 ART-TIME条件培养基培养的原代T细胞，其活化程度（CD25、CD69表达）受到抑制。在条件培养基中检测到免疫抑制因子CCL2和可溶性PD-L1水平升高。当将原代细胞毒性T细胞与含有PD-1/CD2 ART-TIME的肿瘤类器官及靶向HER2/CD3的双特异性T细胞衔接器(BiTE)共培养时，虽然癌细胞杀伤率在测试浓度下无显著差异，但T细胞的活化标记物（CD25、CD69）表达和效应细胞因子（如IFN-γ）的分泌均显著降低，表明PD-1/CD2共信号传导诱导了PDAC细胞的适应性免疫抑制表型。最后，对临床数据的分析发现，在PDAC患者中，CD2配体CD58和PD-1配体PD-L1的共表达与患者总生存期相关，支持了该共信号轴在临床中的潜在重要性。

研究结论与意义

本研究有力地证明了合成细胞模型可以通过细胞自组装过程中的粘附作用，稳定地整合到三维培养物中，形成长期存活的杂交组织架构。这种整合由合成细胞的生物物理特性（界面张力、蛋白调理化、弹性模量）与天然细胞的粘附特性平衡所驱动。研究创建的ART-TIME平台，能够以精简且可控的方式，在三维肿瘤模型中重建特定的免疫受体信号轴。利用该平台，研究人员系统筛选了免疫受体配体的共信号传导，并深入揭示了PD-1与CD2的共信号通过激活蛋白激酶、p53和AhR-ARNT等通路，促使癌细胞分泌免疫抑制因子，从而削弱T细胞功能的分子机制。

这项研究是合成细胞技术与生物医学应用，特别是肿瘤研究领域的一次重要融合。它不仅为在高度仿生的三维环境中逐步构建和研究复杂的肿瘤微环境提供了全新、强大的工具，有望应用于高通量药物筛选和个性化医疗，而且深化了我们对癌细胞如何感知并响应微环境中特定信号的理解。更重要的是，它标志着合成细胞工程在功能性地与生命系统融合方面迈出了关键一步，为未来设计和构建更复杂的生命/非生命杂化功能材料开辟了道路。