靶向猴痘病毒A28蛋白的中和抗体：机制解析与疫苗潜力

《Nature Communications》：Potent neutralization by antibodies targeting the MPXV A28 protein

本研究针对猴痘病毒（MPXV）疫情缺乏高效防治手段的问题，开展了针对病毒表面蛋白A28的中和抗体研究。研究人员从康复者体内分离出靶向A28的单克隆抗体，发现其通过补体依赖性机制（涉及C1q和C3沉积）强效中和MPXV和疫苗病毒（VACV）。高分辨率晶体结构揭示抗体结合A28 N端域的两个邻近保守表位。小鼠实验表明A28免疫可激发强效抗体反应并提供完全保护。该研究将A28确立为有前景的疫苗靶点，为下一代痘病毒疫苗设计提供了新策略。

　　

猴痘（Mpox）疫情近年来呈现频发态势，尤其自2022年以来，猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）新亚支（clade IIb）的出现导致疫情迅速蔓延至全球百余个非流行国家，感染人数超过十万。尽管减毒疫苗病毒（Vaccinia virus, VACV）疫苗MVA（Modified Vaccinia Ankara）的接种在一定程度上控制了疫情，但研究表明其诱导的抗体反应在数月内迅速下降，且其抗原组成与MPXV存在差异。更令人担忧的是，2024年出现了致死率更高的MPXV亚支clade Ib。这些现状凸显了深入理解MPXV免疫靶点、开发更有效防治策略的紧迫性。

MPXV感染或疫苗接种后产生的抗体主要靶向其两种感染形式的表面蛋白：成熟病毒粒子（Mature Virion, MV）和包膜病毒粒子（Enveloped Virion, EV）。在病毒表达的众多表面抗原中，此前仅有8个被报道为中和抗体的靶点。A28（OPG153）是MV的一种重要膜蛋白，它通过结合层粘连蛋白促进病毒附着，并在低pH条件下调控病毒融合机器的激活，从而控制病毒的内体进入过程，是病毒传播和个体间传播的关键因子。尽管研究表明感染或疫苗接种能引发针对A28的抗体反应，但针对该蛋白的中和单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）尚未被报道。

为了解决上述问题，研究人员在《Nature Communications》上发表了题为“Potent neutralization by antibodies targeting MPXV A28 protein”的研究论文。该研究从MPXV康复者体内分离并鉴定了一系列靶向MPXV A28蛋白的人源单克隆抗体，揭示了其强效的中和活性、作用机制和结构基础，并评估了A28作为疫苗靶点的潜力。

为开展本研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：从MPXV康复者队列（样本信息见补充表）采集外周血单核细胞（PBMC），通过流式细胞术分选抗原特异性B细胞；利用单细胞PCR和测序技术获取抗体基因序列，并表达重组单克隆抗体；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和病毒中和试验评估抗体结合和中和活性；通过X射线晶体学解析抗体-抗原复合物结构；利用免疫金标记透射电子显微镜（TEM）观察抗体和补体成分在病毒表面的沉积；在小鼠模型中进行了被动抗体治疗和主动免疫保护实验。

研究结果

从人Mpox康复者中生成mAbs

研究人员首先重组表达了MPXV A28蛋白（残基2-361），并证实其能被大多数康复者血清强烈识别。随后，他们从康复者（感染后1-2个月或9-10个月）的PBMC中，使用流式细胞术分选结合了A28、A35或H3抗原的CD19⁺IgG⁺B细胞。通过单细胞PCR和测序，最终获得了4个靶向A28、9个靶向A35和5个靶向H3的mAbs。大多数抗体能与MPXV及其同源VACV抗原（分别为A26、A33和H3）交叉反应。竞争性ELISA表明，A28靶向的mAbs可分成两个主要的表位群。体细胞高频突变（Somatic hypermutation, SHM）回退实验显示，部分抗体的结合不依赖于SHM，提示其可能为胚系编码。

靶向MPXVA28的抗体表现出强效的补体依赖性中和作用

病毒中和实验显示，靶向A28的mAbs表现出最强大的中和活性，但其效力因MPXV亚支和VACV毒株而异。例如，抗A28 mAb 8M2110中和MPXV clade Ib和IIb的IC₅₀值分别为0.01 μg/mL和3.81 μg/mL。所有测试mAbs的中和作用均依赖补体（使用正常人血清NHS或豚鼠补体GPC），这与之前关于痘病毒抗体的报道一致。而针对EV形式的抗A35 mAbs在本研究主要使用的MV富集病毒制备物中显示出微弱的中和活性。

靶向不同表面蛋白的mAb组合增强MPXV中和

研究人员评估了mAb组合的中和效果。结果表明，对于MPXV和VACV IHDJ毒株，靶向两个不同抗原（如A28和H3）的mAb组合，其中和效果显著优于靶向单一抗原的mAb组合，显示出协同效应。即使单独中和活性很弱的抗A35 mAbs，在与抗A28 mAbs联用时也能增强中和。

8M2110和10M2146 mAbs结合A28 N端域上的两个邻近表位

为了阐明中和机制，研究人员通过X射线晶体学解析了两个强效抗A28 mAbs（10M2146和8M2110）与VACV同源蛋白A26（残基1-397）的复合物结构，分辨率分别为1.9 ?和2.9 ?。结构分析显示，10M2146的表位主要位于A26 N端域（NTD）的α7和α8螺旋，而8M2110的表位则主要位于α10-α13螺旋。两个表位非常接近，部分重叠于α11螺旋。表位残基在MPXV和VACV之间高度保守。两个抗体Fab片段的重叠会产生空间位阻，这解释了为何在ELISA中8M2110无法结合已被10M2146占据的A28。

抗A28 mAbs通过招募C1q和C3阻断病毒感染

机制研究表明，抗体介导的中和作用需要病毒与抗体、补体进行预孵育，缩短预孵育时间会显著降低中和效果，提示抗体主要作用于病毒本身而非感染细胞。尽管mAbs能结合感染细胞并沉积C1q，但在实验条件下未引发补体依赖性细胞毒性（CDC）。使用补体成分抑制剂或缺失血清的实验证实，中和作用不依赖于膜攻击复合物（MAC）的形成，但需要补体成分C1q和C3的沉积。TEM成像直观地展示了IgG、C1q和C3在病毒表面的共存，支持了“完全占据模型”（full occupancy model），即抗体和补体像“分子手铐”一样 immobilize 病毒，阻止其进入细胞。

用A28蛋白进行主动免疫可介导对致死性病毒攻击的体内保护

尽管体外中和活性强效，但预防性给予小鼠抗A28 mAb 8M2110仅能轻微延缓疾病进程，未能提供显著保护，这可能与体内病毒传播以EV形式为主（A28未暴露）有关。然而，用MPXV A28蛋白加佐剂免疫小鼠，能激发高滴度的抗原特异性抗体和B细胞反应，并完全保护小鼠免受致死剂量的VACV攻击。令人惊讶的是，免疫后小鼠的血清即使经过热灭活（去除补体活性），仍保留大部分中和活性，表明A28免疫还能诱导产生不依赖补体的中和抗体。相比之下，用VACV A26免疫的保护效果较差。

讨论与结论

本研究首次系统地表征了靶向MPXV A28蛋白的人源中和抗体，揭示了其作为重要免疫靶点的潜力。A28蛋白在病毒附着和进入过程中扮演的多重功能，使其成为阻断病毒传播的理想靶标。分离到的抗A28 mAbs具有强效、广谱（针对多种VACV毒株和MPXV亚支）的中和活性，且其作用依赖于补体成分C1q和C3的沉积，这符合痘病毒中和的典型特征。高分辨率结构研究揭示了抗体结合的两个邻近保守表位，为理性疫苗设计提供了精确的蓝图。

尽管单一mAb的被动免疫在体内效果有限，但A28主动免疫却能诱导强大的保护性免疫反应，这可能是由于多克隆抗体反应靶向了更广泛的表位，并可能涉及更强的Fc介导功能。A28抗体多为胚系编码的特性，意味着它们易于通过疫苗接种诱导。这些发现共同确立了MPXV A28作为一个有前途的疫苗靶点，支持将其纳入下一代基于mRNA或亚单位的痘病毒疫苗设计中，以诱导更持久、更广泛的保护性免疫，应对不断演变的痘病毒威胁。

该研究的局限性包括仅聚焦于部分病毒抗原，B细胞分选可能存在非特异性结合，以及主要使用VACV而非MPXV进行机制研究。未来的研究将需要探索其他病毒抗原的贡献，并直接在MPXV模型上验证这些发现。总之，这项工作增进了我们对痘病毒免疫应答的理解，并为开发更有效的MPXV治疗和预防策略奠定了坚实基础。