PIK3CA/AKT通路通过激活NRF2介导的ABC转运蛋白表达驱动横纹肌肉瘤的获得性治疗耐药

《Nature Communications》：The PIK3CA/AKT pathway drives therapy resistance in rhabdomyosarcoma

本研究针对横纹肌肉瘤(RMS)对奥拉帕利联合替莫唑胺(OT)及VAC标准化疗方案产生获得性耐药的临床难题，揭示了PIK3CA/AKT通路的异常活化通过磷酸化NRF2并上调多重耐药ABC转运蛋白表达的关键机制。研究发现FDA批准的PI3Kα抑制剂阿培利司(alpelisib)可有效逆转耐药，为克服RMS治疗耐药提供了新的联合治疗策略。

　　

在儿童软组织肉瘤中，横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma, RMS）是最常见的恶性类型，但其治疗依然面临巨大挑战。尽管采用包括长春新碱、放线菌素D和环磷酰胺的VAC方案作为一线化疗，仍有约30%的患者最终复发，而复发后的五年生存率仅为17%，形势严峻。近年来，PARP（多聚ADP-核糖聚合酶）抑制剂奥拉帕利（Olaparib）与DNA烷化剂替莫唑胺（Temozolomide）的联合疗法（OT方案）在临床前研究和部分临床试验中（如尤文肉瘤、小细胞肺癌等）显示出良好前景，并已进入针对青少年横纹肌肉瘤的临床试验（NCT01858168）。然而，与其他癌症类型类似，长期OT治疗也可能诱导耐药性的产生，但其背后的分子机制在RMS中尚不明确，成为阻碍其临床应用的瓶颈。克服耐药性，尤其是理解其根本原因并开发有效策略来逆转或预防耐药，是提高RMS患者生存率的关键。

为了回答这些问题，由David M. Langenau和Chuan Yan共同领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们旨在揭示RMS对OT方案产生获得性耐药的机制，并探索能够克服此种耐药的联合治疗策略。研究人员综合利用了患者来源异种移植（PDX）模型、体外细胞系模型、全基因组测序（WGS）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、小分子抑制剂筛选、功能获得/缺失实验、染色质免疫共沉淀（ChIP）以及活细胞药物示踪（PARPi-FL）等多种关键技术方法。研究的样本队列来源于圣犹达儿童研究医院（St. Jude Children's Research Hospital）和纪念斯隆-凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center）提供的PDX模型以及一系列RMS细胞系。

OT耐药在部分RMS模型中发展

研究人员首先在免疫缺陷的NSG小鼠体内建立了人RMS的PDX模型，并模拟临床给药方案，进行长达五个周期的OT治疗。结果显示，OT治疗能有效抑制所有测试模型的肿瘤生长，但在超过一半（20/36）的移植瘤中，肿瘤最终产生了耐药性。体外长期暴露于递增剂量OT的RMS细胞系实验也证实了这一点，10个模型中有6个产生了耐药。这表明OT耐药是RMS治疗中一个普遍且亟待解决的问题。

OT耐药RMS未出现共同的获得性体细胞突变

考虑到替莫唑胺的诱变特性和PARP抑制剂对DNA修复的抑制，研究人员推测耐药可能源于新的基因突变。然而，通过针对120个常见癌基因和抑癌基因的SNaPshot（单碱基延伸法）分析以及高深度的全基因组测序（WGS），他们发现尽管耐药肿瘤中确实存在因治疗而增加的突变负荷，但这些突变是异质性的，并未在任何耐药模型中鉴定出共有的、可驱动耐药的复发突变。更重要的是，当研究人员通过流式细胞分选术（FACS）分离单个耐药细胞并进行长期无药传代培养后，大部分（6/8）原本耐药的细胞克隆重新对OT变得敏感。这种耐药性的可逆性强烈提示，RMS的OT耐药主要并非由稳定的遗传突变所驱动。

多数OT耐药RMS上调PIK3CA/AKT和MDR通路

既然遗传机制不是主因，研究人员将目光转向了非遗传机制和信号通路。对耐药和敏感肿瘤的蛋白质水平分析显示，在耐药模型中，PI3K p110α（PIK3CA编码）、磷酸化AKT（p-AKT, Ser⁴⁷³）、磷酸化NRF2（p-NRF2, Ser⁴⁰）以及多药耐药蛋白MDR1（ABCB1）的表达显著上调。随后，研究人员对一系列信号通路抑制剂进行了筛选，发现PI3Kα特异性抑制剂阿培利司（Alpelisib）以及泛ABC转运蛋白抑制剂Tariquidar能够选择性地在联合OT时有效杀死耐药细胞，而对亲本敏感细胞影响较小。为了直观验证耐药性与药物外排的关系，他们使用荧光标记的奥拉帕利类似物（PARPi-FL）进行活细胞成像。结果清晰地显示，PARPi-FL能够进入并保留在敏感细胞内，但在耐药细胞中却被快速排出；而当加入阿培利司或Tariquidar后，耐药细胞内的PARPi-FL荧光信号显著增强，表明药物外排被抑制。功能性的eFluxx-ID? Green染料外排实验进一步证实，耐药细胞的ABC转运蛋白活性更高，而阿培利司单药处理即可抑制这种活性。

PIK3CA/AKT通路通过NRF2调控ABC转运蛋白的表达

为了确立因果关系，研究人员在敏感的RD和Rh41细胞中强制表达了持续激活的PIK3CA（H1047R突变）或豆蔻酰化的AKT1（myr-AKT1）。结果发现，激活PIK3CA/AKT通路足以导致MDR1、MRP1（ABCC1）和BCRP（ABCG2）这些ABC转运蛋白的表达上调，并赋予细胞OT耐药性及PARPi-FL外排能力。那么，PIK3CA/AKT通路是如何调控ABC转运蛋白的呢？他们的研究将目标指向了转录因子NRF2。在耐药细胞中，敲低NRF2能够显著降低多种ABC转运蛋白的mRNA和蛋白水平，增强PARPi-FL在细胞内的滞留，并恢复细胞对OT的敏感性。染色质免疫共沉淀（ChIP）实验证实，NRF2直接结合在MDR1、MRP1和BCRP基因的启动子/增强子区域。更重要的是，用阿培利司抑制PIK3CA后，不仅降低了NRF2的磷酸化和总蛋白水平，还显著减少了NRF2在这些ABC转运蛋白基因调控区域的富集。这表明PIK3CA/AKT通路通过促进NRF2的活化及其与DNA的结合，进而转录性上调ABC转运蛋白的表达。

PIK3CA/AKT通路的激活也驱动对VAC的耐药

研究人员进一步探究了这一机制是否也存在于RMS对标准化疗方案VAC的耐药中。他们成功培育出VAC耐药的RMS细胞模型，并发现其中一部分（6/13）同样上调了PIK3CA/NRF2/ABC转运蛋白通路。对于这些模型，阿培利司能够重新使它们对VAC敏感。更重要的是，OT联合阿培利司的方案能够有效杀死这些对VAC耐药的肿瘤细胞。这提示，PIK3CA/AKT通路的激活是RMS获得性多药耐药的一个共同机制。

阿培利司在小鼠异种移植模型中使耐药RMS对OT重新敏感

最后，研究在动物体内验证了联合疗法的效果。在携带OT耐药PDX肿瘤的NSG小鼠中，OT联合阿培利司的三药方案能够显著抑制肿瘤生长、延长小鼠生存期，且未观察到明显的额外毒性。肿瘤组织分析显示，联合治疗组中PIK3CA、p-AKT、p-NRF2和MDR1的表达均显著降低，同时细胞增殖减少、凋亡增加。

研究结论与意义

本研究系统地阐明了横纹肌肉瘤获得性治疗耐药的一个核心非遗传机制：治疗压力下，肿瘤细胞通过（非突变方式）上调PIK3CA/AKT信号通路，进而激活转录因子NRF2，导致多个多重耐药相关ABC转运蛋白（如ABCB1/MDR1, ABCC1/MRP1, ABCG2/BCRP）的表达增加，从而将化疗药物（如奥拉帕利、替莫唑胺、VAC方案中的药物）泵出细胞外，产生耐药。这一发现不仅深化了对肿瘤耐药机制的理解，更重要的是提供了直接的转化医学价值。研究证实，FDA已批准的PI3Kα抑制剂阿培利司能够有效逆转由该通路介导的OT耐药和部分VAC耐药。鉴于阿培利司已在儿童中具有安全性数据并获批用于其他适应症，OT联合阿培利司的方案为治疗复发/难治性RMS提供了一条极具临床转化潜力的新途径。此外，该研究提示，通过免疫组化（IHC）检测肿瘤组织中PIK3CA/AKT/NRF2通路活性或ABC转运蛋白表达，可能作为预测患者对阿培利司联合疗法反应性的生物标志物，用于未来的患者分层和精准临床试验设计。最后，耐药性的可逆性特征支持了在临床治疗中考虑引入“药物假期”的策略，以期让肿瘤细胞从耐药状态回复至敏感状态，从而最大化化疗效果。