GLP-1R通过VAPB/SPHKAP调控β细胞线粒体重塑与功能的新机制揭示

《Nature Communications》：GLP-1R associates with VAPB and SPHKAP at ERMCSs to regulate β-cell mitochondrial remodelling and function

本刊推荐：研究团队针对GLP-1受体（GLP-1R）调控β细胞线粒体功能的具体机制这一前沿问题，开展了关于GLP-1R在ER-线粒体接触位点（ERMCSs）信号转导的深入研究。研究发现，内化后的GLP-1R与内质网（ER）膜接触位点组织因子VAPB结合，进而招募A激酶锚定蛋白SPHKAP，形成PKA-RIα生物分子凝聚体，通过磷酸化MICOS复合物调控线粒体嵴重构，最终增强胰岛素分泌和细胞应激耐受。该研究首次揭示了GPCR通过三组分接触位点调控线粒体功能的分子机制，为理解GLP-1R激动剂（GLP-1RAs）在2型糖尿病（T2D）治疗中的作用提供了新视角。

　　

在2型糖尿病（T2D）这场影响全球约5亿人的健康危机中，胰腺β细胞功能紊乱是核心病理环节。作为血糖调节的核心激素，胰岛素分泌的精密调控离不开线粒体的正常功能。当营养状态变化时，线粒体需要快速重塑自身形态和功能以适应代谢需求，这一过程的失调直接参与T2D的发生发展。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是一种在进食后由肠道分泌的肠促胰岛素，通过激活其特异性G蛋白偶联受体——GLP-1受体（GLP-1R），增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌。GLP-1受体激动剂（GLP-1RAs）在代谢相关组织中显示出改善线粒体健康的显著效果，但连接GLP-1R信号与线粒体功能适应的具体分子机制一直不甚明晰。

发表在《Nature Communications》的这项研究揭开了这一谜题的关键面纱。研究人员发现，GLP-1R激活后形成的信号枢纽并非随机分布，而是精准定位在细胞器的交叉路口——内质网-线粒体接触位点（ERMCSs）。当GLP-1R被激动剂激活并内化后，它会搭乘内含体的“交通工具”前往内质网，与驻留在ERMCSs的“锚定蛋白”VAPB对接。更令人惊奇的是，这一过程还招募了另一个关键角色——SPHKAP，一种与T2D和肥胖风险相关的A激酶锚定蛋白（AKAP）。

这种三方会晤形成了精巧的信号传导平台：GLP-1R-VAPB-SPHKAP复合物引导环磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）信号在ERMCSs局部激活，触发PKA-RIα形成生物分子凝聚体，进而调控线粒体接触位点和嵴组织系统（MICOS）复合物的磷酸化，最终驱动线粒体重塑和功能优化。这就像是细胞内部建起了一个“特快专线”，确保代谢信号能够精准、高效地传达给线粒体。

为了揭示这一机制，研究团队运用了多项前沿技术：通过交互组学分析绘制GLP-1R的相互作用网络；利用荧光共振能量转移（FRET）生物传感器实时监测VAPB定位的cAMP/PKA信号；采用分离GFP接触位点传感器（SPLICS）和相关光镜-电镜（CLEM）技术可视化ERMCSs超微结构；结合MINFLUX纳米显微镜解析蛋白质相互作用的分子距离；并利用原代小鼠和人类胰岛验证生理相关性。

GLP-1Rβ细胞交互组学揭示与ERMCSs定位蛋白的相互作用

研究人员首先通过质谱分析绘制了GLP-1R在激动剂刺激后的相互作用图谱，发现内质网-线粒体接触位点（ERMCSs）组织因子VAPB是GLP-1R最显著的结合伴侣。共免疫沉淀实验证实，exendin-4刺激5分钟后，GLP-1R与VAPB的结合显著增强。共聚焦显微镜和电子显微镜分析显示，激活后的GLP-1R从质膜转移至与VAPB阳性内质网区域紧密相关的内体上，形成内膜接触位点（MCSs）。

GLP-1R与VAPB结合依赖于受体内化过程

通过显性阴性动力蛋白突变体阻断GLP-1R内化，发现GLP-1R与VAPB的相互作用被完全消除。对不同内化特性的GLP-1RAs（包括exendin-4、exendin-F1、exendin-D3、semaglutide、tirzepatide、orforglipron和danuglipron）的比较表明，受体内化能力与GLP-1R-VAPB相互作用强度正相关。NanoBRET分析进一步验证了exendin-4（强内化）相比exendin-F1（弱内化）能诱发更快速的GLP-1R-VAPB相互作用。

Exendin-4刺激的GLP-1R触发VAPB定位的cAMP生成和线粒体外膜PKA活性

利用靶向VAPB的荧光生物传感器（FluoSTEPs），研究人员证实exendin-4刺激可在VAPB位点诱发局部cAMP生成。同时，使用定位在线粒体外膜（OMM）的PKA生物传感器检测到exendin-4刺激可触发线粒体表面PKA活性。与exendin-4相比，内化能力较弱的exendin-F1引起的VAPB定位cAMP和OMM定位PKA反应显著减弱，表明GLP-1R内化对于在VAPB位点产生cAMP和线粒体表面PKA信号至关重要。

Exendin-4刺激的GLP-1R与ERMCSs相关联

通过分离GFP接触位点传感器（SPLICS）和时间推移共聚焦显微镜，研究团队观察到GLP-1R阳性内体与ERMCSs之间存在动态相互作用。室温及低温相关光镜-电镜（CLEM）分析进一步证实，在exendin-4刺激后，GLP-1R阳性内体与VAPB阳性内质网区域紧密对接，且内质网本身与附近线粒体形成接触。免疫电镜分析也在原代小鼠胰岛中观察到类似现象，表明GLP-1R阳性内体-内质网-线粒体三方接触结构的普遍性。

活性GLP-1R通过VAPB与ERMCSs上的PKA-RI招募AKAP SPHKAP相互作用

质谱交互组学分析发现，GLP-1R激活后与AKAP家族成员SPHKAP结合增强。这种相互作用依赖于VAPB，因为VAPB敲低或SPHKAP的pFFAT基序突变（A215E）均能破坏GLP-1R-SPHKAP结合。共定位分析显示SPHKAP定位于内质网位点，且这种定位需要VAPB参与。从exendin-4刺激细胞中分离的线粒体相关膜（MAMs） fraction中同时检测到GLP-1R、VAPB和SPHKAP，证实三者在ERMCSs形成复合物。

ERMCSs定位的GLP-1R依赖性PKA信号需要SPHKAP

SPHKAP敲低不影响GLP-1R与VAPB的结合，也不改变exendin-4刺激引起的全局cAMP生成或全局PKA活性。然而，SPHKAP敲低显著减弱了exendin-4诱导的OMM定位PKA活性和VAPB定位PKA活性。同时，研究人员观察到exendin-4刺激可诱发PKA-RIα阳性点状结构形成，提示生物分子凝聚体组装。

SPHKAP依赖性GLP-1R信号控制线粒体和β细胞功能

功能上，SPHKAP敲低削弱了exendin-4刺激引起的线粒体膜电位升高、ATP水平增加和胰岛素分泌增强。在内质网应激条件下，exendin-4的抗凋亡效应在SPHKAP敲低细胞中也被消除。此外，exendin-4刺激引起的线粒体Ca²⁺反应峰值时间在SPHKAP敲低细胞中延迟，而内质网Ca²⁺反应未受影响。

SPHKAP依赖性ERMCS定位的GLP-1R信号控制线粒体形态

研究人员发现exendin-4刺激可触发MICOS复合物组分MIC19的PKA依赖性磷酸化。SPHKAP和VAPB双敲低导致GLP-1R激活后多个MICOS复合物组分PKA磷酸化水平广泛改变。形态学上，exendin-4刺激10分钟即可引起线粒体网络从高度融合向碎片化表型重塑，这一效应在GLP-1R敲除细胞中消失。SPHKAP敲低本身导致线粒体形态异常，且exendin-4不再引起进一步的形态改变。透射电镜分析显示，exendin-4刺激可降低线粒体面积和每个线粒体的嵴数量，而SPHKAP敲低或GLP-1R敲除则阻断这一效应。

GLP-1R定位和GLP-1R诱导的PKA信号在原代小鼠和人类胰岛的ERMCSs

在原代小鼠和人类胰岛中，邻近连接 assay（PLA）检测到内源性GLP-1R与VAPB和SPHKAP在exendin-4刺激后的相互作用。SPHKAP敲低削弱了exendin-4对胰岛素分泌的增强作用，增加了基础胰岛素分泌，模拟了SPHKAP敲除小鼠模型的表现。同时，SPHKAP敲低破坏了exendin-4诱导的线粒体网络重塑。

讨论与结论部分指出，这项研究首次描述了GLP-1R在ERMCSs组装信号复合物的新机制，揭示了内体GPCR通过三组分接触（内体GPCR-ERMCS锚定蛋白VAPB-PKA招募AKAP）调控线粒体功能的创新范式。该机制不仅解释了GLP-1RAs如何通过线粒体重塑改善β细胞功能，也为理解其它GPCR的亚细胞信号定位提供了新视角。从转化医学角度，SPHKAP基因变异与T2D风险和BMI的遗传关联提示这一通路在人类代谢疾病中的重要性，为开发靶向ERMCS信号的新型糖尿病治疗策略奠定了理论基础。