肾癌中微小染色体外环状DNA携带的miRNA基因扩增促进肿瘤表型

《Cell Reports》：Extrachromosomal circular miRNA-gene amplifications contribute to the renal cancer phenotype

本研究针对小型染色体外环状DNA（eccDNA）在肾癌中的作用机制这一前沿问题，研究人员通过多组学分析发现MIReccDNAs（携带miRNA基因的eccDNA）在晚期肾癌中显著富集且与不良预后相关。功能实验证实合成MIReccDNAs可促进肾癌细胞增殖，首次揭示了小型eccDNA通过miRNA过表达驱动肾癌进展的新机制，为肾癌诊疗提供了新的生物标志物和潜在靶点。

　　

在癌症研究领域，染色体外环状DNA（eccDNA）正成为越来越受关注的角色。特别是那些较大的ecDNA（1-3 Mb），它们能够携带完整的癌基因，并在多种肿瘤中促进肿瘤发生、复发和耐药性。然而，对于更常见的小型eccDNA（100 bp-1 Mb）是否以及如何影响癌症表型，科学家们还知之甚少。肾细胞癌（RCC）作为一种很少携带大型ecDNA的癌症类型，为研究小型eccDNA的功能提供了理想模型。肾癌中miRNA的失调与患者预后密切相关，那么，这些重要的调控分子是否会借助eccDNA这种形式在癌症中"兴风作浪"呢？这正是Han等人在《Cell Reports》上发表的最新研究试图解答的问题。

为了深入探索小型eccDNA在肾癌中的作用，研究人员整合运用了多项关键技术。他们对122对肾癌组织和癌旁正常组织（NAT）进行了全基因组测序（WGS）和Circle-Seq分析，同时对115对样本进行了RNA测序（RNA-seq）。Circle-Seq技术通过核酸外切酶消化线性DNA后，进行滚环扩增和测序，能够特异性地捕获环状DNA。生物信息学分析则包括使用Circle-Map++鉴定eccDNA，AmpliconArchitect分析ecDNA，以及常规流程检测体细胞突变、拷贝数变异（CNA）和结构变异（SV）。功能研究方面，团队通过连接酶辅助迷你环积累（LAMA）方法合成特定的MIReccDNAs，并在786-O和ACHN肾癌细胞系中通过转染实验、Edu染色、伤口愈合和Transwell实验评估其生物学效应。

研究设计和队列信息

本研究纳入了122例肾癌患者，包括99例透明细胞肾癌（ccRCC）、12例嫌色细胞肾癌（chRCC）、7例乳头状肾癌（pRCC）、3例集合管癌（CDC）和1例肉瘤样分化肾癌（sRCC）。研究人员收集了患者的肿瘤组织和癌旁正常组织，进行了WGS、Circle-Seq和RNA-seq分析，构建了一个全面的多组学数据库用于探索eccDNA在肾癌中的作用。

肾癌中的环状DNA谱

通过WGS分析，研究人员仅在1例伴有骨转移的CDC患者中检测到ecDNA，该患者术后20个月内死亡。另外4例患者携带复杂的非环状扩增子，这些患者均表现出较短的无进展生存期。与之形成鲜明对比的是，Circle-Seq分析揭示了小型eccDNA的广泛存在：在肿瘤组织中共鉴定出24,158,364个eccDNA，显著高于癌旁组织中的7,517,410个。肿瘤组织中的eccDNA负荷（标准化为每百万可映射读数的eccDNA数，EPM）中位数为411，显著高于癌旁组织的210。值得注意的是，晚期（II-IV期）肿瘤的eccDNA负荷显著高于早期（I期）肿瘤，且eccDNA高负荷与患者较短的无进展生存期独立相关。

肾癌活检组织中的基因组突变谱

对122对样本的WGS数据分析发现了22,515个体细胞单核苷酸变异（SNV），其中C>G置换占35.9%。突变特征分析揭示了三个主要的COSMIC特征：SBS6和SBS15（与DNA错配修复缺陷相关）以及SBS22（与马兜铃酸暴露相关）。VHL是突变频率最高的基因（49.2%），其他频繁突变的基因包括PBRM1、BAP1、SETD2和TP53等。相关性分析显示，eccDNA负荷与结构变异数量无显著相关，但与拷贝数变异负担呈微弱正相关（R=0.29）。

参与肿瘤发生的miRNA基因在肾癌MIReccDNAs中反复出现

研究人员特别关注了携带miRNA基因的eccDNA（MIReccDNA）。他们在肿瘤中鉴定出14,372个MIReccDNAs，携带1,870个miRNA基因，其中415个在肿瘤中显著富集。功能富集分析显示，这些miRNA的靶基因参与细胞发育、有丝分裂控制和mRNA稳定性等通路。在30个最常检测到的MIReccDNAs中，有5个被选出进行深入分析。生存分析显示，携带MIR107、MIR196a、MIR519或MIR495 MIReccDNA的患者，其无进展生存期显著短于仅携带染色体miRNA编码等位基因的患者。

MIReccDNAs通过miRNA转录增加肿瘤细胞增殖

为了验证MIReccDNAs的功能，研究人员使用LAMA方法合成了携带MIR107、MIR196a-5p、MIR519-3p、MIR495和MIR524基因的环状DNA，并将其转染至786-O肾癌细胞系。qPCR检测证实转染后细胞内相应的miRNA表达水平升高。功能实验表明，与转染随机序列eccDNA的对照组相比，转染任何一个人工MIReccDNA均能显著增强786-O细胞的迁移（伤口愈合实验）、增殖（EdU掺入实验）和侵袭（Transwell实验）能力。在ACHN细胞系中的验证实验也得出了一致的结果。

肾癌中反复检测到携带蛋白质编码基因的eccDNAs

除了miRNA基因，研究还发现eccDNA可携带完整的蛋白质编码基因。在肿瘤组织中鉴定出2,623个携带完整编码基因的独特eccDNAs，显著多于癌旁组织中的826个。这些基因性eccDNA的尺寸主要小于10,000 bp，且在肿瘤中更小（<2,000 bp）。进一步分析发现，有991个在肿瘤中特异性出现的基因性eccDNA与已知的复制起点共定位。在至少四个独立肿瘤样本中出现的基因性eccDNA中，有六个基因（如KRTAP11-1和KRTAP19-8）在eccDNA阳性样本中的转录水平高于阴性样本，但经过错误发现率（FDR）校正后，仅MRPL53仍保持显著差异。

该研究系统地描绘了肾癌中环状DNA的景观，首次提供了令人信服的证据表明小型eccDNA（100 bp-1 Mb）能够通过携带并表达致癌性miRNA基因来促进肿瘤表型。研究发现，与癌旁组织相比，肾癌组织中eccDNA负荷显著增加，且与肿瘤晚期和不良预后相关。特别重要的是，四种特定的MIReccDNAs（MIR107、MIR196a、MIR519和MIR495）的存在与患者较短的无进展生存期显著相关，而体外功能实验证实这些MIReccDNAs能够促进肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，研究还发现eccDNA可携带完整的蛋白质编码基因，其中一部分可能与复制起点共存，并在某些情况下导致基因过表达。

这些发现极大地拓展了我们对eccDNA在癌症中功能多样性的认知。它不仅证实了小型eccDNA是肾癌基因组不稳定的一个重要组成部分，更重要的是揭示了其作为功能性遗传元件，通过"miRNA基因扩增"机制直接参与肿瘤进展。这种机制不同于传统的染色体拷贝数变异或大型ecDNA扩增，代表了一种新的癌基因激活模式。该研究的局限性包括样本来自单中心、缺乏体内实验验证以及eccDNA生成和转录激活的具体机制尚不明确。尽管如此，这项研究为理解肾癌的发病机制提供了新的视角，MIReccDNAs有望成为预测肾癌预后和指导治疗的新生物标志物，甚至为未来开发针对这些环状DNA的疗法奠定了基础。