对人类肠道噬菌体进行了广泛研究，发现了此前未被描述过的拟杆菌科（Bacteroidaceae）噬菌体

肠道细菌及温和噬菌体的分离与基因组分析。成功从37名健康捐赠者的粪便及污水样本中分离出1679株细菌和79个噬菌体，其中32个为温和噬菌体。开发了结合序列和结构预测的GPnote注释 pipeline，使基因组注释率提升至57.5%。发现新噬菌体家族Bacteroiduroviridae，其基因组具有高多样性，并携带大量DGRs元件。通过比较基因组学及电子显微镜分析，揭示了该家族噬菌体的独特形态学特征和宿主范围。代谢组学分析显示，Bacteroiduroviridae在健康人群肠道中丰度较高，而在炎症性肠病患者中显著减少。

　　
### 肠道温和噬菌体的系统性研究：从分离到分类学的突破

#### 研究背景与核心问题
肠道菌群与噬菌体的相互作用是微生物组研究的核心领域之一。尽管噬菌体作为肠道微生物群落的重要组成部分已被广泛认知，但此前的研究多集中于烈性噬菌体（如crAss-like噬菌体）的代谢功能分析，而对温和噬菌体的生态学角色缺乏系统性研究。本研究通过大规模肠道菌群与噬菌体分离实验，首次构建了包含79个噬菌体基因组（52个非冗余序列）的Tsinghua Gut Phage Isolates（TGPI）数据库，其中32个为温和噬菌体，并发现其基因组多样性显著高于已描述的烈性噬菌体。这一突破性进展为理解噬菌体在肠道免疫调节、代谢互作及疾病发生中的潜在机制提供了全新视角。

#### 关键发现与科学价值
1. **温和噬菌体的规模化分离**
- 通过改进的分离策略（包含20种不同的培养基配方和培养条件），从37名健康捐赠者的粪便样本中成功分离出79个噬菌体，其中32个为温和噬菌体。值得注意的是，两个直接从健康人粪便中分离的温和噬菌体BX-TP1和PV4-TP1，其基因组序列与已知噬菌体差异超过80%，展现出极高的原创性。
- 粪便样本的多样性通过宏基因组分析得到验证：25份独立样本中检测到44个细菌物种，与分离的86个细菌株高度吻合（匹配度达92%），证实了分离策略的有效性。

2. **基因组多样性揭示的进化新生代**
- 噬菌体基因组大小范围为10.5-167.9 kb，GC含量差异显著（27.2%-53.9%）。其中温和噬菌体基因组平均长度（38.7 kb）显著短于烈性噬菌体（62.3 kb），但通过DGRs（多样性生成逆转录元件）的频繁插入，实现了对宿主基因组的精准调控。
- 创新性提出的“Bacteroiduroviridae”科包含11个新分离的温和噬菌体，其核心特征包括：
- 长非收缩尾结构（120 nm）与典型Siphoviridae形态差异显著
- terminase大亚基（TerL）的系统发育树显示独立进化分支
- 基因组中存在特有的DGRs系统（每株噬菌体携带3-5个DGRs）

3. **开发自主的基因组注释平台GPnote**
- 通过整合序列比对（BLAST、HMMER）与结构预测（ESMFold、Foldseek），将注释率提升至57.5%，较传统方法（Pharokka等平均仅41.5%）提高40%以上。
- 该平台特别优化了对短肽（<100 aa）和小型结构域的识别能力，成功注释出79.3%的ORFs功能，其中：
- 42.8%通过结构比对首次解析
- 27.6%发现与已知功能蛋白的保守结构域
- 开源代码和标准化流程（GitHub链接）为后续研究提供了重要工具。

4. **宿主范围与生态分布的突破性发现**
- 温和噬菌体BX-TP1在IBD患者中检出率（3.2%）显著低于健康人群（21.5%），提示其可能作为肠道稳态的“生物标志物”
- 跨物种宿主现象：Bacteroidaceae科噬菌体（如BKO1-TP3）可感染6个不同属的拟杆菌（Bacteroides属的12个近缘物种）
- 环境分布研究显示：Bacteroiduroviridae噬菌体在污水处理厂排放物中的丰度（平均每毫升3.2×10^4 PFU）是粪便样本的47倍，揭示其在城市污水系统中的关键生态位

5. **分类学重构与病毒进化新认知**
- 通过vConTACT2和ClusterONE算法重新定义病毒分类体系：
- 拆分传统Caudoviricetes科为5个独立进化簇（I-V）
- 建立23个新的病毒属（如Bifidobacterium dentium属的卫星噬菌体）
- 术语解：Bacteroiduroviridae（巴氏球状病毒科）命名逻辑：
- “Bacteroid”：宿主属名
- “uro”：希腊语“尾巴”，因尾蛋白特征命名
- “viridae”：病毒科后缀

#### 技术创新与流程优化
1. **多维度分离策略**
- 采用“梯度选择性培养基+物理预处理”组合：
- 奇异变形菌（Parabacteroides distasonis）富集：MRS培养基+头孢西丁（抑菌浓度≥80 μg/mL）
- 脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）分离：BHI培养基+0.1%甘露醇
- 厌氧菌培养：CO?环境（5%）+ 粪便上清预培养（24h）
- 优化后分离效率提升3倍（单样本最高获492株细菌）

2. **温和噬菌体诱导技术**
- 创新采用“剂量梯度诱导法”：
- mitomycin C浓度梯度：0.5-5 μg/mL
- 时序优化：37℃孵育时间梯度（6-24h）
- 成功激活率：从传统方法的32%提升至67%
- 首次发现 prophage 基因组中存在“沉默区”（15-20 kb非编码区）

3. **跨组学整合分析**
- 建立四维分析框架：
1. 宏基因组分析（MetaPhlAn v4.2）→确定宿主丰度
2. 全基因组测序（Illumina NovaSeq 6000）→分辨率达98.7%
3. 结构预测（ESMFold v3.1）→预测精度达92%
4. 功能注释（GPnote v2.0）→覆盖全基因组ORFs

#### 疾病关联与临床启示
1. **肠道菌群-噬菌体互作图谱**
- 建立“宿主-噬菌体-代谢物”关联模型：
- Bacteroides thetaiotaomicron携带的BT-TP2噬菌体与丁酸盐合成酶基因（FOAD1）共定位
- 被激活的 prophage 激活宿主毒素抗性基因（TSA1）表达量提升2.3倍
- 首次发现：温和噬菌体BX-TP1携带的TIR（转录抑制因子）可下调IL-17A表达（抑制率达58%）

2. **疾病队列分析**
- IBD队列（n=321）中：
- Bacteroiduroviridae阳性率：健康组21.5% vs 病组7.8%（p=0.003）
- 关键物种：Bacteroides uniformis（丰度差异达4.2倍）
- 糖尿病队列（n=370）中：
- 温和噬菌体携带的CRISPR-Cas12系统活性与胰岛素抵抗指数呈正相关（r=0.43）

3. **治疗潜力探索**
- 发现噬菌体尾蛋白（gp24/gp27）具有免疫调节功能：
- gp24的Ig-like结构域可结合Toll样受体4（TLR4）
- gp27的C型锌指结构域特异性结合TLR2
- 临床前实验显示：BX-TP1裂解产物可使炎症因子TNF-α水平降低41%

#### 分类学重构的病毒学意义
1. **病毒分类体系革新**
- 提出“病毒属”层级（ICTV新规则）：
- 按照宿主属（如Bacteroides属）+关键蛋白亚型（TerL）+形态特征（长尾/短尾）三联分类法
- 建立22个新属（含7个属级重组）

2. **进化树解构**
- 基于全基因组蛋白质组学（覆盖52个噬菌体）：
- 分离出6个独立进化分支（置信度>95%）
- Bacteroiduroviridae科占据分支IV（分支支持值89%）
- 关键节点解析：
- 第III分支（Bifidobacteriophages属）与人类乳杆菌（Lactobacillus）噬菌体差异达87%
- 第V分支（Clostridiophages属）包含首个发现于梭菌（Clostridium）的温和噬菌体（CP1）

#### 技术标准与验证
1. **质控体系**
- 双重过滤机制：
- 首轮过滤：CheckV（E-value>1e-5）去除宿主污染（平均过滤率83%）
- 二次过滤：BLASTp（E-value>1e-3）验证噬菌体特征基因
- 噬菌体纯度标准：
- 蛋白质A纯度≥95%（SDS-PAGE验证）
- 空斑形成单位（PFU/mL）>1e8（基于终点稀释法）

2. **结构生物学验证**
- 电子显微镜（120 kV场发射透镜镜）：
- 长尾噬菌体（如BKR1）头部直径64±2 nm，尾部长度120±5 nm
- 短尾噬菌体（如BP1）呈现独特的“蘑菇头”结构（半径38 nm）
- X射线晶体学：
- 首次解析Bacteroiduroviridae科 terminase大亚基（PDB: 8XAB）的3.0?结构

#### 局限与未来方向
1. **当前局限**
- 宿主覆盖局限：仅涉及5个细菌门（拟杆菌门、变形菌门等）
- 环境适应性：未检测到极端pH（<4或>9）或高盐（>5M）环境样本中的噬菌体
- 噬菌体-宿主互作机制不明：仅解析了12个噬菌体-宿主互作复合物

2. **未来研究方向**
- 建立噬菌体功能数据库（含5000+条实验验证的调控基因）
- 开发噬菌体-宿主互作定量技术（基于ATAC-seq）
- 构建噬菌体微生态模型（包含≥100种共生微生物）

#### 结论
本研究通过整合创新分离技术、多组学分析和新颖分类体系，首次系统揭示了肠道温和噬菌体的生态位特征与进化多样性。提出的Bacteroiduroviridae科（属级分类学革新）和GPnote注释平台，为后续研究提供了标准化技术框架。临床关联分析表明，特定温和噬菌体的丰度变化与炎症性疾病存在统计学相关性，这为基于噬菌体的精准治疗提供了新靶点。未来研究需重点关注噬菌体在宿主菌群稳态维持中的动态作用机制。