菌株NBPZ-032于2025年4月从中国湖北省仙桃市(113.4430°N, 30.3278°E)人工养殖的稻田鳝肠道中分离得到。整个肠道被无菌切除,称重10克后置于10毫升无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中匀浆,随后用PBS进行系列稀释并涂布在溶原菌肉汤(LB)琼脂上。在30°C下孵育2天后(HP150S,瑞华,中国),通过三轮划线法在LB平板上纯化出单个菌落,然后在30°C下用LB培养至对数中期(使用TU-1810分光光度计,PERSEE,中国)。基因组DNA的提取遵循QiAGEN公司的Blood & Cell Culture DNA Mini Kit(Cat#13323)说明书进行,纯度和定量通过NanoDrop One UV-Vis分光光度计(Thermo Fisher Scientific,美国)和Qubit 3.0荧光计(Invitrogen,美国)完成。长读长测序和短读长测序均使用同一份DNA样本进行。长读长测序采用PippinHT系统(Sage Science,美国)对大于10 kb的DNA片段进行选择。DNA文库的制备使用了Ligation Sequencing Kit V14(Cat#SQK-LSK-114;Oxford Nanopore Technologies Ltd. [ONT],英国牛津),无需DNA剪切,并使用Nanopore PromethION测序仪(ONT)在R10.4.1流动池上进行测序。原始序列的碱基校正、条形码分割和接头序列去除采用Guppy v.5.0.16软件(
4)完成。原始数据(97,502条读长,总计1,144,952,152 bp)的平均读长为11,742.86 bp,N50值为24,867 bp;经过碱基校正和接头去除后得到97,497条读长(总计1,144,951,241 bp)。对于短读长测序,使用Covaris LE220超声仪(美国)将基因组DNA随机片段化,再用MGIEasy DNA Clean Beads(Cat#1000005279,MGI Tech Co., Ltd.,中国)将其筛选至2000-4000 bp大小。DNA文库的制备遵循MGIEasy FS PCR Free DNA library preparation set(Cat#1000013455,MGI)流程。测序在DNBSEQ-T7RS平台上进行,采用150个核苷酸长度的配对末端读长。原始数据(7,247,348条读长,总计1,087,102,200 bp)通过fastp v.0.23.1程序(
5)进行预处理,去除接头和低质量数据,最终得到6,975,838条有效读长(总计1,045,312,346 bp)。
利用Unicycler v.0.5.0软件(
6)将完整基因组(总计3,711,769 bp)组装成两个环状复制子:一个3,359,540 bp的环状染色体(GC含量52.01%,深度296.61×)和一个352,229 bp的环状质粒(GC含量49.75%,深度280.43×)。通过Type (Strain) Genome Server进行的系统发育分析显示,该菌株与
P. shigelloides标准菌株NCTC 10360(NCBI组装编号
GCA_900087055)具有密切的进化关系,这一结论得到了GGDC公式2计算得出的75.6%的DNA-DNA杂交值的支持(
7)。通过NCBI PGAP v.6.10(
8)进行注释,鉴定出3,127个蛋白质编码序列、120个tRNA基因和40个rRNA基因。除非另有说明,本研究均采用默认参数。