综述：用于评估硫芥对细胞衰老影响的体外方法

芥子气（SM）是一种导致细胞衰老的化学武器，本文综述其体外研究方法，涵盖不同细胞类型、暴露方式及衰老标志物，提出改进实验设计和开发靶向疗法的新方向。

　　
硫芥（Sulfur Mustard, SM）作为化学武器的重要成分，其对人体组织的长期损伤机制仍是研究热点。本文系统梳理了SM诱导细胞衰老的生物学过程、现有体外研究方法及未来方向，重点探讨如何通过体外模型揭示SM致伤的分子机制，并为治疗策略提供新思路。

### 一、硫芥的生物学效应与致伤机制
硫芥的致伤作用源于其强氧化性和烷基化特性。暴露后，SM通过气态或液态形式渗透组织，在皮肤、呼吸道和消化道等快速更新组织造成持续性损伤。早期症状包括皮肤灼热感、红斑和水疱形成，但更隐蔽的危害在于其引发的细胞衰老。研究显示，SM能破坏DNA双链结构，形成不可修复的交叉连接，导致DNA损伤修复系统过度激活。当细胞检测到持续损伤信号时，会启动DNA损伤反应（DDR），通过激活p53/p21通路或p16/RB通路进入不可逆的衰老状态。

值得注意的是，SM诱导的衰老具有双重特征：一方面通过激活DDR引发程序性衰老；另一方面通过产生活性氧（ROS）造成氧化损伤，形成正反馈循环。这种复合损伤机制使得传统抗氧化剂难以完全逆转其效应，凸显了深入解析SM致衰老机制的重要性。

### 二、体外研究技术的进展与局限
当前体外研究主要采用两种暴露模式：直接接触法（将SM溶解于乙醇或细胞培养基中）和挥发态暴露模拟。其中，皮肤角质形成细胞（NHEKs）和骨髓间充质干细胞是最常用的模型系统。研究显示，浓度在0.1-1 μM范围内即可显著激活衰老相关分泌表型（SASP），且这种效应具有浓度依赖性和时间滞后性（通常在暴露后24-72小时显现）。

在检测方法上，现有技术体系可分为四类：①表型观察（晶状体样体形态、SA-β-gal活性检测）；②蛋白标志物（p16、p21、p53等表达水平）；③功能分析（细胞周期阻滞、增殖能力下降）；④分泌产物检测（IL-6、IL-8等细胞因子）。最新进展体现在微流控芯片技术，可精确控制SM暴露浓度梯度（0.01-10 μM）和暴露时间（6-72小时），为机制研究提供更精细的模型。

但现有研究存在显著局限性：其一，多数体外模型未考虑生物膜动态变化，如皮肤表皮层的三层结构（角质层-表皮层-真皮层）；其二，暴露方式单一，缺乏对多途径复合损伤的模拟（如液态+气态混合暴露）；其三，缺乏长期追踪系统，难以揭示衰老细胞的代际传递效应。

### 三、关键信号通路的解析
1. **DNA损伤应答通路**：SM造成的DNA链交联激活ATM/ATR激酶级联反应，导致p53/p21复合体形成。研究发现，持续激活的DDR会使p21表达水平在72小时内提升3-5倍，同时伴随p16的表达增强，形成双重抑制机制（抑制CDK4/6复合体和RB-E2F转录因子）。

2. **氧化应激-衰老轴**：SM暴露使线粒体膜电位下降达40%，引发ROS爆发性生成（较对照组升高8-12倍）。通过抑制NAD+生成（NADPH氧化酶活性增加）和下调SIRT1表达，ROS介导的衰老信号通过ERK1/2和p38MAPK两条通路传导，最终激活p16基因表达。

3. **炎症微环境形成**：衰老细胞分泌的SASP因子（包括IL-1β、TNF-α和MMP-9）可进一步加剧组织损伤。动物实验显示，持续12周SASP激活会使皮肤愈合速度下降60%，且这种效应具有遗传记忆特性。

### 四、研究方法的优化方向
1. **三维细胞培养系统**：采用类器官技术构建皮肤微环境模型，包括角蛋白形成细胞、黑色素细胞和成纤维细胞。实验数据显示，三维培养体系下衰老细胞的SASP因子分泌量是二维模型的2.3倍。

2. **时间分辨分析技术**：开发基于活细胞成像（活细胞工作站）和时间分辨荧光光谱联用系统，可连续监测72小时内p53/p21蛋白磷酸化状态变化。初步实验表明，SM在暴露后6小时即可激活p53信号通路。

3. **人工智能辅助预测**：利用深度学习模型（如Transformer架构）分析2000+组SM暴露数据，成功预测了12个潜在靶向蛋白（包括PARP1、SMAD3和PI3Kγ）。这些靶点在体外实验中显示，5μM浓度的AZD7762（PI3Kγ抑制剂）可逆转SM诱导的衰老表型。

### 五、转化医学研究的新突破
近期研究发现，SM暴露后产生的氧化应激会激活Nrf2通路，促使细胞产生大量谷胱甘肽。这为开发抗氧化治疗策略提供了新思路：在暴露后4小时内给予白藜芦醇（Resveratrol）预处理，可使皮肤成纤维细胞的衰老相关基因表达量降低至对照组的35%。另一个重要发现是，SM诱导的衰老细胞表面CD147表达量升高2.8倍，靶向抑制CD147的单抗（AAU-CD147）在动物模型中显示出促进伤口愈合的潜力。

### 六、未来研究重点建议
1. **建立复合暴露模型**：整合液态、气态SM暴露，模拟战场复杂环境。建议采用动态暴露装置，实现24小时连续暴露和浓度梯度调节。

2. **开发新型检测指标**：重点研究外泌体携带的miR-34a和miR-199a在衰老细胞中的分泌特征，建立生物标志物检测体系。

3. **精准干预策略**：针对SM暴露后激活的特定通路（如PI3K/AKT/mTOR），设计多靶点药物组合。初步体外实验显示，雷帕霉素（mTOR抑制剂）与NAD+前体（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）联用，可使衰老细胞恢复增殖能力达70%。

4. **长期效应追踪**：建立单细胞水平的时间分辨追踪系统，研究衰老细胞在伤口愈合过程中的迁移和分化行为。特别关注SM暴露后第30天出现的衰老细胞异质性现象。

当前研究已明确SM诱导衰老的关键节点，但如何将体外发现转化为临床治疗仍需突破。建议优先开展以下工作：①建立标准化SM体外暴露规程（参照WHO化学武器检测指南）；②开发自动化高通量筛选平台，重点考察现有抗衰老药物（如雷帕霉素、槲皮素）的协同效应；③加强跨学科合作，整合单细胞测序、空间组学等多维度技术，全面解析SM致伤的分子网络。