基因组拷贝数变异负荷区分原发性真皮黑色素瘤的诊断与预后

《British Journal of Dermatology》：Genomic copy number burden distinguishes the diagnosis and prognosis of primary dermal melanoma

本研究针对原发性真皮黑色素瘤（PDM）与真皮转移瘤难以鉴别诊断的临床难题，通过TSO500靶向测序技术对20例PDM和23例转移瘤进行基因组分析，发现拷贝数变异（CNV）特征是区分两者的关键生物标志物，其中BRAF拷贝数状态可进一步优化PDM患者的预后分层，为临床精准诊疗提供重要分子依据。

　　

在黑色素瘤诊疗领域，原发性真皮黑色素瘤（Primary Dermal Melanoma, PDM）一直是个令人困惑的临床难题。这种局限于真皮的黑色素瘤亚型在组织学上与真皮转移的黑色素瘤几乎无法区分，然而两者的预后却天差地别：PDM患者5年生存率超过80%，而真皮转移患者仅为26%-33%。这种诊断上的不确定性直接影响着治疗决策和患者预后——将PDM误诊为转移瘤可能导致过度治疗，而将转移瘤误诊为PDM则可能错失最佳治疗时机。

目前，PDM的诊断主要依赖临床标准，包括淋巴结评估、全身影像学检查排除其他原发灶或转移灶等，但这些方法仍存在局限性。尽管既往研究尝试通过免疫组化或基因表达特征来区分两者，但基因组层面的差异尚未明确。Cassarino等人发现PDM中p53、Ki-67、cyclin D1和D2-40表达较低，Sidiropoulos团队则报道PDM具有低风险基因特征，然而这些发现均未能转化为可靠的临床诊断工具。

面对这一挑战，由Peinan Zhao、Christopher Chew等研究人员组成的团队在《British Journal of Dermatology》上发表了他们的最新研究成果。他们开展了迄今为止最大规模的PDM基因组学研究，旨在通过基因组特征来区分PDM与真皮转移瘤，从而提高诊断准确性和预后预测能力。

研究团队采用了几项关键技术方法：首先，他们从澳大利亚阿尔弗雷德医院维多利亚黑色素瘤服务中心（Victorian Melanoma Service）收集了2010-2022年间的20例PDM和23例真皮/皮下转移瘤队列，所有病例均经多学科团队确认诊断；其次，利用Illumina TruSight Oncology 500（TSO500）靶向测序panel对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤样本进行基因组分析；最后，通过GATK CNV流程进行拷贝数变异分析，并采用正则化随机森林（Regularised Random Forest, RRF）和Lasso-Cox回归模型进行特征选择和预后分析。

突变特征分析揭示PDM与转移瘤的相似性

研究人员发现，PDM和转移瘤均携带黑色素瘤典型的点突变特征，包括BRAF（PDM 35% vs 转移瘤 30%）、NRAS（均为35%）和TERT启动子突变（PDM 75% vs 转移瘤 83%）。肿瘤突变负荷（Tumor Mutational Burden, TMB）在PDM中略高（43 vs 32突变/Mb），但无统计学显著性差异。这些结果表明，点突变特征本身不足以区分PDM和转移瘤。

拷贝数变异特征成为关键区分标志

研究中最显著的发现是拷贝数变异（Copy Number Variation, CNV）特征的差异。虽然两组样本的基因组受影响百分比（Percentage of Genome Affected, PGA）无显著差异，但转移瘤表现出更大的倍体变异和更高的全基因组加倍（Whole-Genome Doubling, WGD）事件频率。通过GISTIC分析，研究人员在转移瘤中鉴定出4个显著缺失区域（9p21.3、11q23.3、14q13.2和17p11.2），而PDM仅在第9号染色体短臂24.1区域（9p24.1）有显著缺失。

进一步分析显示，转移瘤中癌基因如PDGFRA、FGF2、EGFR、CDK6、BRAF、MET和MYC的拷贝数增益更为频繁和显著，而抑癌基因PTEN（10号染色体）和MGA（15号染色体）在转移瘤中更易缺失。这些发现表明，基因组不稳定性是黑色素瘤进展和转移的重要特征。

极端局灶性扩增仅见于转移瘤

研究团队在13%（3/23）的转移瘤样本中发现了高水平局灶性扩增（定义为估计拷贝数增益超过5倍）。其中一例样本（Metastasis_19）在4q12区域出现约70倍的PDGFRA扩增，经荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）验证确认为高水平扩增。由于染色体4着丝粒为二倍体，这种局灶性PDGFRA扩增可能存在于染色体外DNA（extrachromosomal DNA, ecDNA）中，这是癌基因过度表达的重要机制。另外两例转移瘤分别携带CDK4（12q14.1）和CCND1/FGF19/FGF4（11q13.3）的高水平扩增，而PDM样本中未发现此类极端扩增事件。

机器学习模型确认CNV的诊断价值

通过正则化随机森林（RRF）模型，研究人员从184个基因组特征中筛选出5个拷贝数簇（包含7号、13号、15号、10号染色体基因和PDGFRA基因），这些特征在区分PDM和转移瘤方面表现出色。仅基于这5个CNV特征的随机森林分类器性能（平均AUC=0.8）优于包含所有特征的全模型（平均AUC=0.6），证明CNV是区分两者的最强生物标志物。

BRAF拷贝数状态优化预后分层

最具临床意义的发现是BRAF拷贝数状态对预后的预测价值。通过Lasso-Cox回归分析，研究人员发现临床诊断和BRAF拷贝数是无事件生存期（Event-Free Survival, EFS）的最强预测因子。将患者按临床诊断和BRAF拷贝数状态分层后，BRAF中性的PDM患者表现出最佳的EFS，显著优于BRAF增益的PDM患者和转移瘤患者。将BRAF拷贝数状态纳入临床诊断标准显著改善了预后预测能力（P=0.027，似然比检验），表明BRAF拷贝数提供了独立于临床诊断的额外预后信息。

这项研究的意义不仅在于提供了区分PDM和真皮转移瘤的分子标志物，更重要的是为临床决策提供了实用工具。研究发现，即使是按照标准临床标准诊断为PDM的患者，如果存在BRAF拷贝数增益，其预后与转移瘤患者相似，这提示这部分患者可能被错误分类，或至少应该考虑更积极的辅助治疗策略。BRAF拷贝数状态可通过FISH等常规病理技术检测，易于整合到临床实践中。

此外，PDM中较高的TMB趋势引发了关于其细胞起源的新思考。研究人员推测，PDM可能起源于毛囊深处或真皮定位的前体细胞，这些位置紫外线B（UVB）穿透有限但紫外线A（UVA）可到达，可能导致不同的突变积累模式。

该研究的局限性包括样本量相对较小，以及FFPE样本DNA质量可能影响分析结果。未来研究需要在更大队列中验证这些发现，并探索CNV特征在指导治疗决策中的具体应用。

总之，这项研究首次系统揭示了PDM与真皮转移瘤在拷贝数变异层面的本质差异，建立了基于CNV特征的诊断和预后分层模型，特别是BRAF拷贝数状态的预后价值为临床精准医疗提供了重要依据。这些发现不仅解决了黑色素瘤诊断中的实际难题，也为理解黑色素瘤的基因组进化提供了新的视角，具有重要的理论意义和临床转化价值。