爪蟾卵提取物中碱基切除修复的独特途径：长片段修复主导及与人类细胞修复机制的对比

《Nucleic Acids Research》：Pathways and products of base excision DNA repair in Xenopus laevis eggs: contrast with human cell pathways

本研究针对碱基切除修复(BER)中短片段修复(SP-BER)和长片段修复(LP-BER)通路选择机制不明确的问题，通过对比非洲爪蟾卵提取物(HSS)和人类细胞(HEK293)的修复途径，发现爪蟾系统中80%-90%为2核苷酸修复片段，且修复不依赖DNA聚合酶β(Polβ)而依赖复制聚合酶δ/ε。研究首次证实仅需Polβ的5'-dRp裂解酶活性即可促使修复向SP-BER转化，并发现DNA超螺旋结构和序列背景显著影响修复片段长度。该成果为理解不同细胞状态下的DNA修复调控提供了新视角。

　　

在我们身体的每个细胞中，DNA每时每刻都面临着内源性损伤的威胁——自发脱嘌呤、碱基脱氨基化、活性氧自由基攻击等过程不断发生。这些损伤若不被及时修复，将导致突变积累和细胞功能异常。碱基切除修复(BER)作为 frontline 防御系统，负责清除绝大多数内源性DNA损伤。然而，BER包含两种截然不同的修复途径：仅替换1个核苷酸的短片段修复(SP-BER)和替换2-10个核苷酸的长片段修复(LP-BER)。长期以来，科学家们困惑于细胞如何在这两种途径间做出选择，以及不同DNA聚合酶在其中的具体作用。

尤其令人费解的是，某些氧化性损伤必须通过LP-BER途径修复，而DNA修复酶的表达水平随细胞周期和分化状态剧烈波动。例如，终末分化的肌肉细胞和神经元前体细胞中，Fen1酶的下调会显著限制LP-BER能力，导致细胞对氧化损伤更加敏感。这表明修复通路的选择可能与细胞的增殖状态密切相关。

在这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究中，Stony Brook大学的Zhouyiyuan Xue等科学家选择了一个独特的模型系统——非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵提取物。爪蟾卵在受精后立即启动快速DNA复制的特殊生理状态，使其成为研究复制相关修复机制的理想模型。与典型体细胞不同，爪蟾卵中复制DNA聚合酶(Polδ、Pole)和Fen1的表达水平远高于Polβ，这为探索不同聚合酶在BER中的作用提供了天然实验条件。

研究人员改进了质量标记BER探针技术，能够直接读取SP-BER和LP-BER的修复结果。通过对比爪蟾卵提取物与人类胚胎肾细胞(HEK293)提取物的修复特征，揭示了两种物种在BER机制上的深刻差异。

关键技术方法包括：质粒基底物构建与寡核苷酸交换技术、质量标记BER修复片段分析系统、爪蟾卵高速上清液(HSS)制备、人类细胞全细胞提取物制备、细胞周期同步化(双胸苷阻断法)、免疫共沉淀蛋白敲除、蛋白质印迹分析以及统计学组成的Dirichlet回归分析。

爪蟾卵提取物中的碱基切除修复特征

研究发现爪蟾HSS对多种损伤（尿嘧啶、各种脱碱基位点）均表现出强大的BER活性。令人意外的是，HSS无法修复8-氧代鸟嘌呤(8-oxoguanine)这一重要致突变损伤。更为出乎意料的是，HSS的BER不依赖于通常参与SP-BER的DNA聚合酶β(Polβ)，而是被抑制复制DNA聚合酶δ和ε的阿菲迪霉素(aphidicolin)所阻断。添加人源Polβ可恢复完整修复，但仅需其5'-修剪活性，而非DNA聚合酶功能。

DNA聚合酶在爪蟾卵提取物中的BER贡献

通过抑制剂实验证实，HSS中BER主要依赖复制聚合酶而非Polβ。添加ddTTP对U:A和F:A底物修复影响有限，与HSS中Polβ含量极低的情况一致。添加重组人Polβ能在阿菲迪霉素存在下恢复U:A底物的完整修复，但对F:A LP-BER底物仅部分恢复。

爪蟾卵提取物生成的DNA修复合成片段

质量标记分析显示，爪蟾BER修复片段中80%-90%为2核苷酸LP-BER片段，仅约20%为可能的SP-BER。补充Polβ可将BER转向1核苷酸(SP-BER)片段，且受周围序列影响。仅需Polβ的裂解酶活性而非聚合酶功能即可实现这一转变。Polλ也能产生类似效果。

序列背景和DNA三级结构对修复片段大小的影响

DNA超螺旋状态显著改变修复片段分布，超螺旋U质粒显示<10%的1核苷酸产物，约25%的2核苷酸产物，其余为更长片段。下游序列GC含量较低时，更容易产生长修复片段。5'端切除是爪蟾BER常见事件，约80%修复产物伴随1-2核苷酸的5'端切除。

爪蟾与哺乳动物BER系统的对比

HEK293细胞提取物中的BER主要依赖Polβ，对阿菲迪霉素不敏感但被ddTTP阻断。细胞同步化至G1-S期并未改变这一依赖性。hFen1免疫剔除显著增加1核苷酸修复产物比例，而重新添加hFen1可恢复非剔除提取物的模式。人细胞BER修复片段主要為2核苷酸，且未检测到5'端切除。

研究结论与意义

该研究揭示了BER通路选择的关键分子决定因素，强调复制聚合酶、DNA拓扑结构和序列背景在塑造修复通路选择中的重要作用。爪蟾卵系统中LP-BER的主导地位反映了其准备快速DNA复制的特殊生理状态，而人类细胞中Polβ的核心作用则代表了典型体细胞的修复模式。

研究首次证实仅需Polβ的5'-dRp裂解酶活性即可促使修复向SP-BER转化，为理解不同DNA聚合酶在BER中的分工提供了新视角。发现DNA超螺旋结构和序列背景对修复片段长度的显著影响，表明体内BER可能比体外系统显示更强的LP-BER偏向性。

特别值得注意的是，爪蟾卵系统缺乏8-氧代鸟嘌呤修复能力，这可能与其低温生活史和短暂受精前寿命相适应。5'端切除现象的发现揭示了BER过程中额外的复杂性，而物种间在这一特征上的差异（爪蟾常见，人类缺失）则提示了修复机制的进化多样性。

这些发现对理解不同细胞状态（如细胞周期阶段、分化状态）下的DNA修复调控具有深远意义，为开发针对特定修复通路的抗癌策略提供了理论基础。研究建立的质粒底物和修复片段分析系统也为未来研究体内BER效率和保真度提供了强大工具。

研究还通过微注射实验证明，质粒底物在爪蟾卵内15分钟内即可被完全修复，凸显了工程化质粒作为研究体内BER反应新工具的潜力。未来工作有望克服技术限制，深入探索早期胚胎发生过程中的BER效率和保真度。