DNA连接酶1处理氧化损伤末端单链断裂的机制研究：结构生物学揭示连接反应保真性的新见解

《Nucleic Acids Research》：Processing of DNA single-strand breaks with oxidatively damaged ends by LIG1

本刊推荐：为解决氧化应激下DNA连接酶1(LIG1)如何处理3‘-末端为8-氧化鸟嘌呤(8-oxodG/8-oxorG)的单链断裂这一关键问题，研究人员开展了LIG1/缺口DNA复合物的晶体结构解析。研究发现LIG1通过结构微调区分8-oxoG的双重编码潜能（反式Watson-Crick配对与顺式Hoogsteen配对），导致突变性或非突变性连接，为理解DNA修复末端连接保真性提供了原子水平的机制见解。

　　

在我们身体的每个细胞中，DNA每时每刻都面临着内外部因素的攻击，其中活性氧(ROS)造成的氧化损伤尤为严重。这种由氧气呼吸副产物和环境毒素引发的损伤，特别容易发生在鸟嘌呤碱基上，形成最常见的氧化损伤产物——8-氧化-2'-脱氧鸟嘌呤(8-oxoG)。更令人担忧的是，细胞内的核苷酸池也同样脆弱，dGTP和rGTP会被氧化成8-oxodGTP和8-oxorGTP，这些"坏零件"可能被DNA聚合酶错误地插入基因组。

问题的关键在于8-oxoG具有双重编码潜能：当它以反式(anti)构象与胞嘧啶(C)形成Watson-Crick配对时，是非突变性的；而以顺式(syn)构象与腺嘌呤(A)形成Hoogsteen配对时，则会导致突变。这种特性使得含有8-oxoG的DNA修复中间产物变得异常危险，特别是在DNA修复的最后一步——连接反应中。作为负责连接DNA断裂的主要酶，DNA连接酶1(LIG1)需要准确判断是否连接这些含有氧化损伤的末端，这一决定直接影响着基因组的稳定性和细胞命运。

为了揭示LIG1如何处理这一难题，研究人员在《Nucleic Acids Research》上发表了他们的最新发现。他们采用X射线晶体学技术，解析了LIG1与含有3'-8-oxodG和3'-8-oxorG的缺口DNA复合物的高分辨率结构。通过生物层干涉技术测定DNA结合动力学，并结合体外酶活性分析，系统评估了LIG1对不同氧化损伤末端的连接效率。同时，研究人员还探讨了AP内切核酸酶1(APE1)在修复过程中的校对功能。

结构分析揭示了LIG1的精细调控机制

研究人员成功解析了LIG1与五种不同缺口DNA底物的复合物结构：LIG1^EE/AA/3'-8-oxodG:A、LIG1^WT/3'-8-oxodG:C、LIG1^EE/AA/3'-8-oxodG:C、LIG1^EE/AA/3'-8-oxorG:C和LIG1^EE/AA/3'-8-oxorG:A。这些结构分别捕获了连接反应的不同阶段，为理解酶促反应机制提供了直接证据。

结构比较显示，LIG1根据8-oxoG的配对方式（Watson-Crick或Hoogsteen）采取不同的结构适应策略。当8-oxodG与模板C形成Watson-Crick配对时，酶-底物复合物停留在预催化阶段（DNA-AMP中间体形成）；而当8-oxorG与模板A形成Hoogsteen配对时，反应则推进至后催化阶段（磷酸二酯键形成）。

构象变化决定连接效率

通过叠加不同结构的原子坐标，研究人员观察到8-oxoG的糖基构象存在显著差异，这直接影响了缺口处+1和+2核苷酸的相对位置。当8-oxodG与A形成Hoogsteen配对时，其脱氧核糖基发生了明显位移，导致+2核苷酸移动达1.2-1.3 ?。

更为重要的是，8-oxorG与标准核糖核苷酸的结构比较揭示了关键差异：氧化损伤使8-oxorG向缺口的5'-PO₄末端移动约1 ?，改变了3'-OH与活性位点残基D570的空间关系，同时保持了与R871的相互作用网络。这种微妙的构象调整解释了为什么LIG1能够以不同效率处理不同类型的氧化损伤末端。

连接效率验证结构观察

体外连接实验结果显示，LIG1对含有3'-8-oxodG:A和3'-8-oxorG:A的缺口底物表现出高效的突变性连接，而对3'-8-oxodG:C的连接效率则显著降低（约100倍差异）。有趣的是，LIG1对3'-8-oxorG:C的连接效率介于两者之间，说明核糖核苷酸的存在影响了酶对氧化损伤的识别。

值得注意的是，LIG1野生型与EE/AA突变体（E346A/E592A，低保真变体）在连接效率上没有显著差异，这表明在Mg²⁺存在条件下，高保真界面并不是区分氧化损伤末端的关键因素。然而，在无Mg²⁺条件下，只有3'-8-oxorG:A能够被有效连接，这与晶体结构中观察到的后催化状态相一致。

APE1参与损伤末端的校对

研究人员进一步探讨了APE1在修复过程中的作用。结果显示，APE1能够时间依赖性地移除与模板A配对的8-oxorG，并与LIG1协同完成缺口的最终连接。然而，APE1对其他类型氧化损伤末端的切除活性相对较弱，说明其底物特异性与损伤类型和配对方式密切相关。

机制创新与生物学意义

本研究最重要的发现是提出了LIG1通过结构微调来区分8-oxoG双重编码潜能的分子机制。当8-oxoG以Hoogsteen方式与A配对时，其构象灵活性有利于3'-末端向5'-PO₄靠近，促进连接反应；而以Watson-Crick方式与C配对时，结构刚性反而抑制了有效连接。

这一发现对理解癌症发生和神经系统疾病具有重要意义。肿瘤细胞中较高的氧化应激水平会导致更多氧化核苷酸的积累，而LIG1对这些损伤末端的处理方式直接影响突变累积的速度。同时，神经细胞中氧化RNA的积累与神经退行性疾病密切相关，本研究为理解DNA修复系统如何应对类似损伤提供了重要参考。

研究还揭示了APE1与LIG1在修复过程中的功能协调，这种多蛋白复合物的协同作用确保了DNA修复末端连接的准确性。在氧化应激条件下，这种协调机制对于维持基因组稳定性尤为关键。

该研究的发现不仅深化了我们对DNA修复机制的理解，还为开发新的治疗策略提供了潜在靶点。针对DNA连接酶的小分子抑制剂可能成为选择性杀伤高氧化应激癌细胞的有效工具，而调控这一通路也可能为抗菌药物开发提供新思路。

总之，这项研究通过高分辨率结构生物学方法，揭示了DNA连接酶在维护基因组完整性中的精细调控机制，为理解氧化应激条件下的DNA修复保真性提供了原子水平的见解，对基础生物学和临床应用都具有重要意义。