网络药理学、转录组学以及计算与实验验证的综合性策略揭示了juglone通过ROS/PI3K/AKT通路发挥的抗骨肉瘤作用

《European Journal of Pharmacology》：Integrated Strategies of Network Pharmacology, Transcriptomics, and Computational and Experimental Validation Reveal the Anti-Osteosarcoma Effects of Juglone via the ROS/PI3K/AKT Pathway

骨肉瘤治疗中胡桃醌通过ROS/PI3K/AKT通路抑制细胞增殖并诱导凋亡，分子模拟证实其与PI3K、AKT1结合稳定，但存在潜在毒性需评估。

　　

郝川淼|刘宝龙|潘新芳|程志华|薛琪珍|韩东达|余中山|张立伟|白熙壮

中国大连医科大学，大连116044

摘要

目的

骨肉瘤（OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤，预后较差，这凸显了开发新疗法的必要性。Juglone是一种天然萘醌类化合物，显示出一定的治疗潜力；然而，Juglone对骨肉瘤的作用机制及其背后的生物学原理仍有待阐明。

材料与方法

通过U2OS和HOS细胞系验证了体外实验结果。利用网络药理学方法预测了Juglone的作用靶点，随后构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并进行了GO/KEGG富集分析。转录组学分析进一步证实了这些结果。使用AutoDock Tools和Discovery Studio进行了分子对接实验，GROMACS分子动力学模拟（MD）证实了Juglone与靶点复合物的稳定性。体内实验进一步明确了Juglone的生物学效应。ADME/T分析使用了Swiss和Protox软件。

结果

Juglone能够抑制骨肉瘤细胞的存活能力，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖和迁移，并诱导细胞进入G2/M期停滞。共鉴定出234个靶点；蛋白质-蛋白质相互作用分析显示TP53、AKT1、BCL2、CTNNB1和STAT3是关键相互作用因子。富集分析显示Juglone与氧化应激和PI3K/AKT通路相关。分子对接结果显示Juglone与PI3K和AKT1具有高亲和力，分子动力学模拟也证实了这一结合的稳定性。在体内实验中，Juglone显著抑制了肿瘤生长，并具有良好的短期生物安全性。ADME/T分析表明其药代动力学特性良好，但存在潜在的毒性风险。

结论

本研究首次证明了Juglone通过ROS/PI3K/AKT通路发挥抗骨肉瘤作用。体内实验结果证实了其强大的肿瘤抑制效果及良好的短期安全性，为其临床应用提供了支持。

引言

骨肉瘤（OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤，发病率在10-30岁的青少年和年轻成人中最高（Meltzer和Helman，2021；Siegel和Miller，2019）。尽管目前的标准治疗方案结合了手术干预和系统性化疗，但非转移性病例的五年生存率仍低于70%（Beird等人，2022；Meltzer和Helman，2021）——这一治疗困境主要归因于肿瘤本身的化疗耐药性和强烈的转移倾向。尽管新辅助治疗方案不断改进，但临床疗效四十年来几乎没有显著提升。超过80%的患者会对一线化疗药物（如顺铂、多柔比星）产生耐药性，导致肿瘤复发和肺转移（Beird等人，2022；Chen等人，2021；Gill和Gorlick，2021）。此外，微环境缺氧和M2极化的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）会形成协同机制，进一步加剧治疗耐药性（Costa等人，2024；Marchais和Marques da Costa，2022；Yu等人，2022b；Zhou等人，2017）。这些未解决的挑战迫切需要开发具有优化毒效比的分子靶向疗法。

天然化合物因其低系统毒性和有限的不良反应而成为有前景的抗癌候选物（Atanasov等人，2021；Kashyap等人，2021）。大量证据表明植物活性成分具有显著的抗肿瘤作用（Islam等人，2022；Tian等人，2024）。值得注意的是，截至2019年，FDA批准的247种新型抗癌药物中约有一半直接来源于天然产物或其结构衍生物（Newman和Cragg，2020），这突显了天然药效团在肿瘤学中的关键作用。Juglone（5-羟基-1,4-萘醌）是从胡桃属植物中提取的一种活性醌类化合物，对多种恶性肿瘤具有多种抗肿瘤作用机制，包括促凋亡、抗增殖和抗转移作用（Bayram等人，2018；Cenas等人，2006；Guo等人，2024；Hu等人，2023；Wang等人，2018；Wang等人，2019b；Xu等人，2012；Zhang等人，2021；Zhang等人，2019）。然而，其针对骨肉瘤的治疗效果和作用机制尚未得到充分研究。

为了系统地阐明Juglone的抗骨肉瘤机制，本研究采用了综合方法，结合了（1）生物信息学技术（包括网络药理学、转录组学、分子对接和分子动力学模拟）和通路富集分析来预测药物-靶点相互作用，以及（2）从体外细胞实验到体内裸鼠异种移植模型的实验验证。研究表明，Juglone通过ROS/PI3K/AKT通路发挥抗骨肉瘤作用。ADME/T分析表明其具有作为治疗候选物的潜力，但也强调了进行全面临床前安全性评估的必要性。通过整合药物-靶点相互作用的计算预测、通路富集分析、功能验证实验和ADME/T评估，全面解析了Juglone的抗肿瘤活性和临床应用前景。这项工作为克服骨肉瘤提供了有前景的策略，并推动了基于天然产物的新疗法的研发。

实验部分

细胞培养

人类骨肉瘤U2OS和HOS细胞系由中国科学院细胞库（上海）提供。U2OS细胞在McCoy’s 5A培养基（PM150710；Procell，武汉）中培养，HOS细胞在MEM培养基（MEM；PM150410；Procell，武汉）中培养，两者均添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS；CF-01P；Cellbox，中国）。

细胞活力分析

使用CCK-8试剂盒（KTA1020；Abbkine，武汉）评估了Juglone对骨肉瘤细胞活力的影响。

Juglone在骨肉瘤细胞中表现出细胞毒性和凋亡效应

Juglone是一种天然萘醌类化合物（图1A）。为了研究Juglone对骨肉瘤的细胞毒性，我们通过CCK-8试剂盒量化了其对U2OS和HOS细胞的毒性作用。Juglone剂量和时间依赖性地降低了细胞活力（图1B-C, E-F），24小时半数抑制浓度（IC50）分别为2.84 μM（U2OS）和2.76 μM（HOS）。后续实验中使用2–4 μM的Juglone处理24小时。形态学观察显示细胞密度降低、细胞形态圆润化以及细胞死亡增加（图1D）。

讨论

骨肉瘤的治疗面临诸多挑战，尤其是高转移倾向和对传统化疗的耐药性（Beird等人，2022）。由于现有治疗方法的毒性较大，患者常出现严重不良反应。因此，有效的治疗药物需要同时抑制肿瘤生长和转移、克服药物耐药性、降低毒性，并通过联合用药来提高治疗效果（Adewuyi等人）

CRediT作者贡献声明

韩东达：方法学设计、数据管理。余中山：项目监督、资金获取。张立伟：项目管理、资金获取。白熙壮：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。潘新芳：资源协调、项目管理、资金获取。程志华：实验设计、数据管理、概念构思。薛琪珍：方法学设计、数据管理。郝川淼：初稿撰写、数据可视化、结果验证、实验设计。

伦理声明

本研究已获得中国医科大学医学动物研究伦理委员会的批准（批准编号：CMU20242070）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

数据共享

本研究使用的数据集可应合理要求向通讯作者索取。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（81671811, 82202738）和辽宁省自然科学基金（2024-MS-259）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。