卵母细胞体外成熟过程中糖胺聚糖失调对发育潜能的影响：细胞外基质信号传导的关键作用

《Glycobiology》：Dysregulation of glycosaminoglycans during oocyte maturation in vitro: Implications for developmental potential

本研究针对体外成熟(IVM)卵母细胞发育潜能低的问题，通过系统分析小鼠卵丘-卵母细胞复合物(COC)在体内外成熟过程中糖胺聚糖(GAG)的动态变化，发现IVM导致硫酸化GAGs（特别是肝素硫酸(HS)和软骨素硫酸(CS)）显著减少甚至缺失，且与Ext1/Ext2基因表达下调、卵丘扩张受损及胚胎发育能力下降密切相关。研究首次阐明特定硫酸化模式（CS-4S、CS-4S6S、HS-NS）在卵丘基质中的主导地位，为优化IVM技术提供了新靶点。

　　

在辅助生殖技术领域，卵母细胞体外成熟(IVM)是一项重要技术，特别适用于多囊卵巢综合征(PCOS)患者或避免卵巢过度刺激的周期。与体内成熟相比，IVM获得的卵母细胞虽然能够完成核成熟，但其发育潜能明显降低，表现为受精后胚胎形成率和囊胚发育率显著下降。这一现象背后的分子机制尚未完全阐明，成为制约IVM技术广泛应用的关键瓶颈。

卵母细胞被一层特殊的体细胞——卵丘细胞所包裹。在排卵前，卵丘细胞合成并分泌大量的细胞外基质(ECM)，形成一种黏弹性结构，导致卵丘细胞向外扩张，这一过程称为卵丘扩张。该基质以透明质酸(HA)为骨架，并包含携带糖胺聚糖(GAG)侧链的蛋白聚糖，如硫酸软骨素蛋白聚糖和硫酸肝素蛋白聚糖。这一结构不仅对排卵至关重要，还作为分子过滤器调节溶质扩散，并作为信号分子的储库，通过结合生长因子（如卵母细胞分泌的GDF9和BMP15）来调控卵母细胞的成熟环境。在体内，这一过程的启动依赖于垂体释放的黄体生成素(LH) surge所诱导的卵泡内表皮生长因子(EGF)样肽段的释放。

研究人员推测，IVM条件下卵母细胞发育潜能降低，可能与未能成功重建一个功能完整的卵丘细胞外基质有关，特别是其中糖胺聚糖的组成和硫酸化模式。虽然已知蛋白聚糖是卵丘基质的组成部分，但具体的GAG组成及其在成熟过程中的动态变化，尤其是在体内与体外条件下的差异，此前并不清楚。为了解决这一问题，来自澳大利亚阿德莱德大学和麦考瑞大学的研究团队在《Glycobiology》上发表了他们的研究成果。

本研究主要采用了以下关键技术方法：使用小鼠模型，分别通过注射hCG诱导体内成熟或在含有EGF和FSH的培养基中进行体外成熟；利用Blyscan法定量总硫酸化GAG含量；通过锆离子亲水相互作用液相色谱(ZIC-HILIC)结合高效液相色谱(HPLC)技术，精确测定卵丘-卵母细胞复合物中透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)和硫酸肝素(HS)不同硫酸化形式二糖的含量；采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)分析相关基因（如Has2、Ext1、Ext2、Sdc1、Gpc1）的表达；并通过形态学观察、体外受精(IVF)和胚胎培养评估卵丘扩张、受精率和胚胎发育潜能。

硫酸化糖胺聚糖在卵丘-卵母细胞复合物成熟过程中的丰度

研究人员首先比较了体内和体外成熟6小时和16小时后小鼠COCs中总硫酸化GAG的丰度。发现体内成熟16小时后，总硫酸化GAG含量较6小时点显著增加了1.5倍。然而，在体外成熟过程中，GAG丰度没有发生显著变化。更重要的是，在16小时点，体外成熟的COCs其硫酸化GAG含量比体内成熟组低2.1倍。这表明体外培养环境未能重现体内成熟的信号环境，导致硫酸化GAGs的积累不足。

卵母细胞体内外成熟过程中COC内糖胺聚糖种类的丰度

为了更精细地解析GAG组成，研究人员利用ZIC-HILIC-HPLC技术分析了HA、CS和HS的具体二糖种类在成熟过程中的变化。

对于透明质酸(HA)，体内成熟12小时和16小时后，其丰度分别较6小时点显著增加了7.1倍和1.6倍。而体外成熟组在12和16小时的HA水平显著低于体内成熟组。尽管体外成熟早期Has2基因（负责HA合成）表达显著上调，但HA的积累量远低于体内，提示体外条件下基质的稳定性或HA的滞留能力存在缺陷，而非合成不足。

对于硫酸软骨素(CS)，在检测的八种常见CS二糖中，有四种在小鼠COC中被发现：CS-0（非硫酸化）、CS-4S（4位硫酸化）、CS-6S（6位硫酸化）和CS-4S6S（4,6位双硫酸化）。体内成熟12小时后，总CS丰度较未成熟状态(0h)显著增加4.6倍，16小时时虽有所下降，但仍高于未成熟状态。CS-4S是体内成熟后COC中最主要的硫酸化形式，在12小时点显著增加27倍。CS-6S和CS-4S6S也呈现类似的先增后降的趋势，但丰度较低。然而，在整个体外成熟过程中，所有CS种类的丰度均未发生显著变化，且在各时间点均显著低于体内成熟组，尤其在12小时和16小时点，总CS含量分别低7.5倍和4.8倍。CS-4S6S在未成熟和体外成熟的COCs中甚至检测不到。

对于硫酸肝素(HS)，在八种检测的二糖中，只有HS-NS（N-硫酸化）和HS-2SNS（2位、N位双硫酸化）在体内成熟的COC中被检测到。总HS丰度在体内成熟12小时显著增加，16小时有所回落但仍高于未成熟状态。HS-NS是主要的HS种类。令人惊讶的是，在任何时间点的体外成熟COCs中，均未能检测到HS的存在。

COCs在体内外成熟过程中Ext1和Ext2的表达

HS合成起始的关键限速酶由Ext1和Ext2基因编码。体内成熟16小时后，Ext1的表达显著上调；而Ext2的表达从8小时起就持续高于未成熟状态。相比之下，在体外成熟过程中，Ext1和Ext2的表达均未发生显著变化。在16小时点，体外成熟组的Ext1和Ext2 mRNA水平分别比体内成熟组低3.7倍和1.7倍。这解释了为何体外成熟条件下无法检测到HS，可能是由于未能有效上调HS生物合成的关键基因。

成熟条件对卵母细胞发育潜能的影响

为了确认体外成熟及相关GAGs缺失对卵母细胞发育潜能的影响，研究人员评估了卵母细胞的成熟状态、卵丘扩张、受精能力以及胚胎发育情况。虽然体外成熟卵母细胞的核成熟进程与体内相似，但其卵丘扩张程度显著低于体内成熟组。一个有趣的现象是，体外成熟卵母细胞的受精率反而高于体内成熟组。然而，这些受精卵发育至囊胚阶段的比例显著降低了5.6倍。这表明体外成熟卵母细胞虽然更容易受精，但其支持后续胚胎发育的潜能（发育潜能）严重受损。

研究人员还检测了卵丘细胞标志基因Has2、Ptgs2以及蛋白聚糖核心蛋白基因Sdc1（ syndecan 1）和Gpc1（glypican 1）的表达。发现Sdc1和Gpc1在体外成熟过程中的表达反而高于或类似于体内成熟。这表明，尽管这些蛋白聚糖的核心蛋白转录上调，但其翻译后的GAG链修饰（即GAG侧链的添加）过程在体外受到损害，核心蛋白的表达与GAG的生物合成之间存在脱节，这可能是对基质形成受损的一种代偿反应。

本研究首次系统描绘了小鼠卵丘-卵母细胞复合物在成熟过程中糖胺聚糖组成的动态变化图谱，并揭示了体外成熟(IVM)导致GAGs，特别是具有特定硫酸化模式的硫酸软骨素(CS-4S, CS-4S6S)和硫酸肝素(HS-NS, HS-2SNS)显著减少甚至缺失。这种GAGs的失调与卵丘扩张受损、卵丘基质屏障功能减弱以及卵母细胞发育潜能下降密切相关。研究结果表明，IVM环境未能支持功能性卵丘细胞外基质的形成，尤其是其GAG组分的正确组装。GAGs的缺失很可能破坏了基质对卵母细胞分泌的生长因子（如GDF9、BMP15）的捕获、稳定和信号传导功能，同时也可能削弱了基质的分子过滤功能，从而影响了卵母细胞的最终质量。此外，核心蛋白聚糖基因表达与GAG链合成的脱节提示了IVM条件下转录后调控的缺陷。

这项研究的意义在于，它将卵母细胞发育潜能与一个此前被忽视的因素——卵丘基质中特定糖胺聚糖的精细组成——联系起来。这些发现为理解IVM效率较低的机制提供了新的视角，并指出了潜在的改进策略。例如，未来研究可以探索在IVM培养基中补充特定的GAGs或能促进GAG合成的因子，以期恢复基质的信号传导和屏障功能，从而提高体外成熟卵母细胞的发育能力，最终改善辅助生殖技术的结局。研究强调，优化体外培养环境，使其更好地模拟体内卵泡微环境，特别是细胞外基质的复杂组成和功能，是提升IVM技术效果的关键所在。