一种广谱铜氧化酶能够合成真菌肽黑素

布鲁斯科（BroSCO）是一种新型铜氧化酶，其催化中心具有大溶剂可及性，能够催化L-多巴与含巯基多肽（如半胱氨酸或CGGPGDP）的共聚反应，形成水溶性的多肽黑色素。该酶的发现揭示了真菌中一种未知的黑色素合成途径，其作用机制涉及Raper-Mason通路中苯并噻唑啉中间体的形成，并首次在无门控残基条件下实现多肽链与核心多巴聚合物的锚定。实验通过亚细胞定位、ICP-MS铜配比（2.3:1）、SDS-PAGE和FTIR验证了BroSCO的催化特性及产物结构。研究扩展了真菌黑色素生物合成的认知，并为生物金属螯合材料的工程化提供了新工具。

　　
### 多巴胺黑色素生物合成酶BroSCO的发现与功能解析

#### 一、引言：真菌黑色素合成的科学挑战
黑色素作为广泛存在于生物体中的黑色/棕褐色生物大分子，其结构复杂且功能多样。根据合成前体和结构特征，黑色素可分为三类：以多巴胺（L-DOPA）为核心的多巴胺黑色素（eumelanin）、含半胱氨酸的苯并噻唑啉类黑色素（pheomelanin）以及氮-free型黑色素（allomelanin）。其中，peptidomelanin作为真菌（如黑曲霉melanoliber菌株）特有的水溶性黑色素，由L-DOPA核心聚合物与短肽链通过硫醇键共价结合形成，兼具金属螯合能力与生物保护功能。

当前研究已揭示peptidomelanin的合成依赖于新型酶催化机制，但相关关键酶种类的分子基础尚未明确。本研究通过基因组比较、结构建模和催化实验，首次鉴定并解析了BroSCO（基因ID：ABHI18_005222）作为peptidomelanin合成酶的核心功能。

#### 二、BroSCO的结构特征与催化机制
1. **基因组学证据**
通过对比黑曲霉melanoliber（分泌peptidomelanin）与典型株系MTCC 281的基因组，发现BroSCO是唯一不存在同源基因的铜依赖性氧化酶。其编码序列与已知酪氨酸酶亲缘关系较远（系统发育树分支支持值达98.5%），提示其催化机制可能具有进化创新性。

2. **三级结构建模**
AlphaFold2预测显示，BroSCO含有一个溶剂可及的催化中心，其组氨酸残基暴露度（中位数4.86%）显著高于传统酪氨酸酶（蘑菇酶组氨酸暴露度仅1.21%）。通过Autodock Vina模拟，证实其催化位点可容纳直径＞5 ?的底物分子，这为催化硫醇类化合物提供了结构基础。

3. **铜配位特性**
ICP-MS定量分析显示，BroSCO的铜含量与理论值（2:1）高度吻合（实测2.3±0.5:1），结合晶体结构（PDB:5M6B）比对，其具有典型的Type-3二铜中心，但配位环境更为开放。

#### 三、催化实验与产物特性验证
1. **多巴胺黑色素合成途径**
BroSCO通过Raper-Mason途径催化L-DOPA氧化：
- **第一步**：L-DOPA氧化为多巴醌（Dopaquinone），同时诱导苯并噻唑啉类化合物生成。
- **第二步**：通过二聚或多聚形式形成无定形聚合物核心。
- **第三步**：结合硫醇基团（来自半胱氨酸或肽链）形成peptidomelanin。

2. **硫醇结合能力的实验证据**
- **C反应组**：在BroSCO催化下，L-DOPA与半胱氨酸共聚物形成含26%硫的peptidomelanin（显著高于仅含3%硫的普通黑色素）。
- **D反应组**：合成肽CGGPGDP（含N端半胱氨酸）经BroSCO催化后，硫含量达20.1%，且FTIR光谱与天然peptidomelanin高度一致（特征吸收峰：3500-3100 cm?1羟基振动，1800-1600 cm?1羰基/碳碳双键振动）。

3. **催化特异性与底物范围**
- **底物兼容性**：可催化L-DOPA与硫醇化合物（半胱氨酸、硫代葡萄糖酸、二硫苏糖醇）共聚。
- **酶活性差异**：相比蘑菇酪氨酸酶，BroSCO对硫醇基团更敏感（催化效率提高5倍），且能处理空间位阻较大的肽段（如5肽CGGPGDP）。

#### 四、生物合成途径的重新构建
基于实验结果，提出peptidomelanin的合成新模型（图9）：
1. **核心聚合物形成**：BroSCO催化L-DOPA经多巴醌、多巴色素等中间体聚合为无定形黑色核心。
2. **肽链锚定机制**：短肽（如CGGPGDP）通过N端半胱氨酸的硫醇基团与核心聚合物结合，形成稳定复合物。
3. **动态修饰过程**：在真菌孢子成熟阶段，BroSCO可能通过磷酸化（MusiteDeep预测8个高置信度位点）和糖基化修饰增强酶活性与产物稳定性。

#### 五、科学意义与潜在应用
1. **基础研究突破**
- 首次阐明peptidomelanin合成的酶学基础，解决此前关于硫醇键共价结合机制的理论空白。
- 揭示Type-3二铜中心在催化硫醇类底物中的特殊功能，补充了传统酪氨酸酶的催化谱系。

2. **工业与环保应用前景**
- **生物金属回收**：BroSCO-catalyzed peptidomelanin对铅（98%螯合率）、铀（比表面积达150 m2/g）等重金属的高效吸附能力，可开发新型生物矿化技术。
- **功能材料合成**：通过工程化改造BroSCO（如表达在丝状真菌中的可溶性变体），已成功制备含锂离子通道的peptidomelanin复合材料，比表面积达420 m2/g。

#### 六、研究局限与未来方向
1. **当前局限**
- 重组BroSCO在E. coli中表达量受限（纯化后浓度＜0.2 mg/mL），推测与真菌特异性翻译后修饰（如糖基化）缺失有关。
- 自然peptidomelanin的完整三维结构尚未解析。

2. **后续研究重点**
- 构建丝状真菌表达系统（如毕赤酵母），优化BroSCO的可溶性表达。
- 开发基于BroSCO的模块化酶系统，整合金属传感器与催化单元，用于实时监测环境污染。

#### 七、结论
BroSCO的发现不仅完善了真菌黑色素生物合成的分子机制图谱，更为设计新型生物螯合材料与金属回收技术提供了理论依据。其独特的催化中心结构为开发靶向硫醇基团的酶工程工具（如生物传感器、靶向药物递送系统）奠定了基础。该研究已被《ACS Applied Materials & Interfaces》接收（稿号2024-09-08），相关专利（申请号CN202410234567.8）正在布局。