iPSC来源的iNKT细胞：一种具有促造血功能的新型通用型细胞疗法

《Stem Cell Reviews and Reports》：Generation of iPSC-Derived iNKT Cells with Pro-Hematopoietic Activity

本研究针对造血干细胞移植（HSCT）后造血重建困难及移植物抗宿主病（GVHD）风险高的问题，通过将人CD4+Vα24+Vβ11+iNKT细胞重编程为iPSC（iNKT-iPSC），并建立无饲养层3D球体分化体系，成功再生出功能性i-iNKT细胞。该细胞不仅保留CD1d限制性抗原识别能力，且分泌GM-CSF、IL-3等促造血因子，显著促进髓系祖细胞扩增与分化，为开发"现货型"细胞疗法增强造血重建提供新策略。

　　

在血液系统恶性肿瘤和免疫缺陷疾病的治疗中，造血干细胞移植（HSCT）是挽救生命的关键手段。然而，移植前高强度化疗造成的骨髓环境损伤、造血干细胞植入效率低、移植物抗宿主病（GVHD）风险以及移植后免疫重建缓慢，仍是临床面临的严峻挑战。近年来，免疫细胞疗法为改善HSCT预后带来新希望。其中，恒定自然杀伤T（invariant natural killer T, iNKT）细胞因其独特的免疫调节功能备受关注。这类先天样T细胞不仅具有抗肿瘤活性，还能通过分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-3（IL-3）等细胞因子，直接促进骨髓造血干/祖细胞（HSPC）的扩增与分化。更重要的是，iNKT细胞通过识别非多态性CD1d分子提呈的脂质抗原激活，不会引起GVHD，使其成为理想的"通用型"免疫细胞治疗候选。

然而，iNKT细胞在人体外周血中含量极低（<0.1%），体外扩增易混杂常规T细胞，增加GVHD风险；且异体移植时可能因HLA不匹配被宿主免疫系统清除。如何获得高纯度、可规模化制备且具有免疫豁免特性的iNKT细胞，是实现其临床转化的核心难题。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSC）技术为突破这一瓶颈提供了可能。通过将体细胞重编程为iPSC，再定向分化为目标细胞，可实现细胞产品的标准化、规模化制备，并能通过基因编辑赋予其免疫豁免特性。尽管已有研究成功从iPSC再生出iNKT细胞（i-iNKT），但其是否保留促造血功能尚未可知。

在此背景下，威斯康星大学麦迪逊分校的Igor I. Slukvin和Jenny E. Gumperz团队在《Stem Cell Reviews and Reports》发表最新研究，首次建立了从人CD4⁺iNKT细胞重编程为iPSC，再通过3D球体分化体系高效生成功能性i-iNKT细胞的完整技术路线，并证实其具有与体细胞iNKT相当的促造血活性。

关键技术方法概述

研究团队从人外周血分选CD4⁺Vα24⁺Vβ11⁺iNKT细胞，通过无SV40大T抗原的仙台病毒载体将其重编程为iNKT-iPSC；随后建立胶原IV包被的3D球体悬浮分化体系，通过时序添加CHIR99021（WNT激动剂）、SB-431542（TGF-β抑制剂）等小分子调控Notch信号，诱导产生CD34⁺造血祖细胞；最后通过OP9-DLL4饲养层共培养促进T淋巴细胞定向分化，获得i-iNKT细胞。功能验证包括CD1d-α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer）四聚体结合、转录因子染色、细胞因子分泌检测及Transwell共培养实验评估其对脐带血CD34⁺细胞扩增与分化的影响。

研究结果

1. 成功建立iNKT细胞来源的iPSC系

研究人员通过流式分选结合CD1d-α-GalCer四聚体标记，从人外周血获得高纯度CD4⁺iNKT细胞，经体外扩增后使用Cytotune-iPS 2.0仙台病毒系统进行重编程。获得的iPSC克隆呈现典型人多能干细胞形态，核型正常，高表达OCT4、SOX2、NANOG等多能性标志物。基因组PCR检测证实除个别克隆外，绝大多数iPSC均保留iNKT细胞特有的TRAV10-TRAJ18（Vα24-Jα18）TCR重排，验证其细胞来源。

2. 3D球体分化体系高效生成CD34⁺造血祖细胞

为提升造血分化效率，团队开发了无饲养层的3D球体分化策略。通过悬滴法形成直径75–150 μm的iPSC球体，将其接种至胶原IV包被的培养板，在低氧条件下时序添加BMP4、VEGF、FGF等细胞因子，并优化CHIR99021与SB-431542浓度以激活动脉程序。分化第5天，约50%的CD144⁺CD43^?CD73^?hemogenic endothelium（HE）表达动脉标志DLL4和CXCR4；第9天收集的悬浮细胞中，CD34⁺比例超过90%，其中70%共表达CD43，表明高效生成多能造血祖细胞。

3. iNKT-iPSC成功再分化为功能性i-iNKT细胞

将CD34⁺祖细胞与表达人DLL4的OP9饲养层共培养4周，获得CD3⁺TCRVα24⁺Vβ11⁺i-iNKT细胞，其CD45、CD3表达水平与体细胞iNKT相当，并能特异性结合α-GalCer负载的CD1d四聚体。值得注意的是，尽管来源自CD4⁺iNKT细胞，再分化后的i-iNKT表现为CD4^?CD8α⁺CD8β^?表型，且体外扩增后未恢复CD4表达。

4. i-iNKT细胞保留关键转录因子谱与细胞因子分泌能力

通过胞内染色发现，i-iNKT细胞与体细胞iNKT均高表达PLZF（先天样功能主控因子），且T-bet（调控IFN-γ）、GATA-3（调控IL-4/IL-13）、E4BP4（调控IL-10/IL-13）表达水平高度一致。抗CD3刺激后，i-iNKT细胞分泌GM-CSF、IL-3、IFN-γ、IL-13的水平与体细胞相当，但未检测到IL-4分泌，提示重分化过程可能伴随IL-4基因表观遗传沉默。

5. i-iNKT细胞具备促造血活性

通过Transwell共培养实验发现，经抗CD3激活的i-iNKT细胞可显著促进脐带血CD34⁺HSPC扩增（约2倍），并驱动其向CD34^?Lin⁺髓系细胞分化。尤为重要的是，i-iNKT细胞组中CD34⁺Lin^?细胞数量显著高于体细胞iNKT组，提示其或更具支持HSPC自我更新的潜力。直接共培养实验未发现i-iNKT细胞对HSPC的杀伤作用，排除其对造血功能的负面影响。

结论与展望

本研究首次构建了从体细胞iNKT到iPSC再至功能性i-iNKT细胞的完整技术闭环，证实i-iNKT细胞不仅保留抗原特异性识别能力，还通过分泌GM-CSF、IL-3等关键因子发挥促造血作用。其区别于体细胞iNKT的CD4^?表型与IL-4分泌缺失，提示重编程与再分化过程可能重塑细胞功能特性，未来可通过DNA去甲基化编辑尝试恢复IL-4表达。此外，i-iNKT细胞与CD1d⁺抗原呈递细胞（如树突状细胞）的相互作用模式、体内抗GVHD效应及对移植物抗白血病（GVL）活性的影响，仍需进一步探索。

该研究为开发基于iPSC的"现货型"iNKT细胞疗法奠定坚实基础，尤其对改善HSCT后造血重建、降低GVHD风险具有重要临床意义。结合基因编辑技术，未来可进一步构建靶向肿瘤抗原的CAR-i-iNKT细胞，或通过调控E4BP4等转录因子增强其抗炎功能，拓展其在自身免疫病、感染性疾病等领域的应用前景。