综述：调控作物和采后系统中乙烯通路的合成蛋白策略

《Discover Plants》：Synthetic protein strategies for modulating ethylene pathways in crops and postharvest systems

本综述系统探讨了如何利用从头蛋白设计（de novo protein design）这一前沿合成生物学技术，精准调控植物激素乙烯（ethylene）的生物合成通路。文章聚焦于通过设计合成ACC氧化酶（ACO）调节剂、ACC结合/螯合蛋白以及基因编码生物传感器等新兴模式，实现对乙烯通路的重编程，为延长农产品（尤其是跃变型果实）采后保鲜期、减少损耗提供了超越传统化学抑制剂和基因编辑技术的、可调且正交的新工具，在精准农业和可持续食品供应链中具有广阔应用前景。

　　

引言

乙烯，一种简单的气态碳氢化合物，作为关键的植物激素，在植物生长发育和应激响应中扮演着多面手角色。它调控着诸如果实成熟、花朵衰老、叶片脱落以及对生物和非生物胁迫响应等关键生理过程。在跃变型果实中，乙烯是启动成熟的主要触发器。然而，其不受控的产生会导致过早成熟、加速腐败和严重的采后损失，对全球农业和食品供应链构成重大挑战。

乙烯的生物合成受到一条代谢通路的严格调控，其中1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）氧化酶（ACO）是终端且限速的酶。传统调控方法如化学抑制剂或基因敲除虽有一定效用，但存在脱靶效应、监管障碍和对乙烯信号抑制不完全等局限性。近年来，合成生物学和计算蛋白设计领域的进展为以空前精度工程化生物系统开辟了新途径。从头蛋白设计允许创建具有定制功能的全新蛋白质，为重新设计ACO或开发可高特异性调节乙烯生物合成的正交调控蛋白提供了变革性机遇。

ACC氧化酶：结构、功能及生物学意义

ACO催化ACC氧化裂解生成乙烯、二氧化碳和氰化物，该氧化反应需要分子氧和抗坏血酸作为必需辅因子。ACO对ACC表现出显著的底物特异性，其生化机制涉及ACC在ACO活性位点的立体特异性结合，通过铁依赖的氧化裂解实现。在跃变型果实成熟过程中，ACO活性急剧增加，触发了协调颜色变化、质地修饰和香气挥发物产生的自动催化乙烯爆发。

ACO的活性受到复杂的多层控制系统调控，整合了发育信号和环境信号。在转录水平，组织特异性启动子和激素响应元件调节ACO基因表达模式。翻译后机制进一步通过磷酸化级联和氧化还原敏感性修饰来微调酶活性。ACO的三维结构揭示了其酶功能的关键结构决定因素。作为Fe(II)依赖性双加氧酶超家族成员，ACO具有一个保守的果冻卷折叠，将催化铁中心定位在疏水口袋内。

从头蛋白工程：原理与新兴技术

从头蛋白设计代表了与传统方法根本性不同的范式转变。传统蛋白工程通过理性诱变或定向进化对现有生物支架进行迭代优化，而从头设计则基于第一性原理，构建完全新颖的蛋白结构，不受进化先例的约束。该领域的发展得益于计算物理、机器学习和结构生物学的进步。

核心计算平台如Rosetta使用基于能量的评分函数探索多肽链的广阔构象空间。深度学习领域的突破，如AlphaFold和RoseTTAFold，通过从进化数据中学习氨基酸序列与其三维构象之间的映射，极大地加速了结构预测。除了预测，生成模型正被用于发明采用所需折叠的新颖蛋白序列。

尽管计算设计能力强大，生物系统通常需要经验性优化以达到最佳性能。定向进化通过使设计的蛋白质经历迭代的诱变和选择轮次，模拟自然进化，弥合了这一差距。将设计的蛋白质整合到生命系统中的合成生物学工具进一步扩展了从头工程的范围。

合成ACO调节剂：设计从头结合剂以调节活性

合成蛋白设计的新兴领域为通过开发靶向ACC氧化酶（ACO）的人工调节剂来精确控制乙烯生物合成开辟了新的可能性。最有前景的方法涉及工程化在结构上模拟天然底物ACC但缺乏其反应性的合成结合剂，创建竞争性抑制剂，占据活性位点而不产生乙烯。

在跃变型果实的采后管理中，合成ACO抑制剂的农业应用尤其引人注目。通过战略性地减少供应链关键阶段的乙烯生产，这些调节剂可以显著延长易腐商品的商业窗口期。蛋白质基抑制剂的非毒性性质使其在化学残留物引发监管和消费者接受度挑战的食品系统中特别有吸引力。

观赏园艺同样受益于合成ACO调控。可将蛋白质基抑制剂配制成花瓶溶液或保护性喷雾，保护花卉组织免受乙烯影响而不改变其视觉或嗅觉吸引力。蛋白质设计的模块化允许创建组织特异性调节剂，保护脆弱的花器官，同时允许正常的营养生长。

合成ACO调节剂的递送策略是一个活跃的创新领域。转基因表达提供最持续的调控，具有组织特异性或诱导型启动子的潜力。对于非转基因解决方案，蛋白质配方技术的进步使得叶面应用成为可能，其中工程化蛋白质穿透角质层到达靶标。

设计用于实时乙烯监测的生物传感器

用于实时监测乙烯生物合成的精密工具的开发，代表了基础植物生物学和农业生物技术的变革性进步。这些创新的核心是专门识别乙烯直接代谢前体ACC的从头设计的蛋白质结合剂。

这些生物传感器在基础植物研究中的应用，揭示了乙烯信号动力学的新维度，这是以前无法获得的。该平台能够可视化果实成熟或花朵衰老等发育转变过程中的ACC分布模式，以细胞分辨率绘制乙烯生物合成的时空协调图。当与活细胞成像结合时，这些工具揭示了环境胁迫如何触发局部ACC产生，并将其作为化学通讯在组织中传播。

精准农业将极大受益于这些生物传感技术。含有ACC生物传感器的工程化植物可以作为活体哨兵，在可见症状出现之前光学报告乙烯相关胁迫。在受控环境农业中，配备生物传感器的植物网络可以将实时数据馈送到气候控制系统，通过与低成本成像系统或便携式荧光计集成，为将作物管理从反应性实践转变为预测性实践创造机会。

ACC螯合策略用于乙烯控制

通过工程化ACC结合蛋白进行代谢前体拦截的新兴方法，提供了一种不直接靶向ACO本身即可控制乙烯生物合成的革命性方法。该策略涉及设计高亲和力蛋白质结合剂，作为分子海绵，在ACC被ACO转化为乙烯之前，在细胞质中选择性地螯合ACC。

ACC螯合的农业应用对于管理跃变型果实的成熟过程尤其具有变革性。通过控制游离ACC库的可用性，种植者可以精确操纵成熟窗口期以适应市场需求或物流限制。该技术能够前所未有地延长前跃变期，同时在需要时保持同步、均匀成熟的能力。

除了采后应用，时间控制能力为协调大田作物的发育事件开辟了新的可能性。在棉花中，精确计时释放被螯合的ACC可以使棉铃开裂同步化，从而实现更高效的机械采收。对于叶菜类蔬菜，暂时的ACC螯合可能在夏季热胁迫期间延迟衰老，而不损害植物在需要时利用乙烯进行防御反应的能力。

非转基因实施途径显著扩展了该技术的潜在应用范围。含有ACC结合蛋白的蛋白质喷雾配方可以在关键发育阶段或采收前施用，提供乙烯控制而无须永久性遗传修饰。蛋白质稳定性的最新进展允许这些喷雾在田间条件下保持活性，同时可生物降解且食品安全。

实施挑战与未来方向

将用于乙烯调控的从头蛋白质设计从实验室概念转化为农业应用面临着几个关键的实施挑战。最突出的技术障碍之一是确保合成蛋白质在引入植物系统时的稳定性和生物利用度。工程化蛋白质必须在植物细胞质的复杂生化条件下保持其结构完整性和功能性。

在转基因和非转基因递送系统之间的选择提出了另一个重大的实施挑战，每种方法都有不同的技术和监管考虑因素。转基因表达具有持续、组织特异性蛋白质生产的优势，但在许多市场面临漫长的审批过程和持续的消费者接受障碍。对于非转基因方法，开发能够穿越植物细胞壁和膜的有效蛋白质递送载体仍然是一个重大障碍。

实施这些技术的一个关键考虑因素是确保工程化蛋白质的特异性，以避免意外的代谢干扰。虽然从头设计旨在精确靶向ACC或ACO，但仍存在与结构相似代谢物发生脱靶相互作用或重定向代谢流产生意外后果的可能性。

监管和消费者接受度问题或许是这些新兴技术最复杂的实施挑战。从头设计蛋白质的新颖性质要求开发不同于传统转基因生物或化学农药使用的风险评估框架。将这些合成蛋白质的精确工程原理和安全设计方法进行清晰沟通，对于监管批准和公众信任至关重要。

展望未来，最有前景的实施可能涉及与新兴智能农业技术的整合，以创建响应式的精准农业系统。将乙烯生物传感器与蛋白质基调节剂相结合，可以实现闭环控制系统，根据作物状态和环境条件的实时监测自动调整乙烯水平。

成本、可扩展性及工业适用性

蛋白质基乙烯调节剂与两种主要生产范式兼容：微生物发酵和植物基分子农业。工业部署受益于干燥、稳定的剂型。完善的辅料可以在与加工和储存相关的热应激中抑制聚集并保持活性，实现可重构或掺入涂层的环境稳定粉末。

我们设想了三条具有不同成本结构和纯度要求的实用近期路径：采后喷雾/洗涤添加剂、用于纸箱或气调室的香囊/垫材/衬垫，以及用于研究或利基园艺的植物表达（瞬时）蛋白质。

蛋白质调节剂是可生物降解的，并且通常具有高度特异性，符合零售商和消费者对低残留投入品的偏好。在许多司法管辖区，蛋白质基活性成分在生物农药框架内进行评估，这为用于农业和采后环境的蛋白质活性物质指明了明确的监管类别。

投资潜力与农业影响

全球易腐作物采后损失带来的经济负担估计超过每年1万亿美元，这为下一代乙烯控制技术创造了巨大的市场机会。成功的乙烯控制技术的农业影响将远远超出直接的经济回报，可能重塑全球食品系统。通过有效将成熟与采收时间解耦，这些创新有助于平衡目前导致粮食浪费和短缺的供需失衡。

植物合成生物学领域的初创企业生态系统经历了显著增长，农业生物技术初创公司获得了数十亿美元的投资。新兴参与者展示了市场对解决采后挑战的生物解决方案的需求。将乙烯控制技术与供应链物流和冷链管理相结合，产生了强大的协同效应，放大了其经济影响。

结论

从头蛋白质工程的出现为操控乙烯生物学带来了一个变革时代，为控制农业中最关键的调控分子之一提供了前所未有的精度。正如本综述所强调的，设计合成ACO调节剂、工程化ACC结合蛋白和实时生物传感器的能力，代表了超越传统乙烯管理策略的量子飞跃。

展望未来，这些技术的整合预示着一个未来，即植物发育性状可以通过设计的生物分子以分子精度进行控制。下一代农业投入品可能包括蛋白质基调节剂，这些调节剂可由特定的环境线索激活或在预定的发育窗口期施用，为种植者提供对成熟、衰老和胁迫响应的前所未有的控制水平。

也许最引人注目的是这些技术对可持续农业的承诺。下一代ACO调节剂和乙烯监测系统可以显著减少食物浪费，同时减少对能源密集型冷链基础设施的依赖。通过可生物降解的蛋白质配方精确控制成熟和衰老的能力，符合消费者对高质量农产品和环境友好型农业实践日益增长的需求。

将蛋白质基乙烯控制转化为实践的关键在于稳健的可制造性、稳定的配方、针对蛋白质活性物质的暴露现实生态毒理学，以及与生物农药/EU-1107监管框架的早期对接。近期优先事项包括在包装厂条件下进行标准化持久性测定、并排靶向配方矩阵、适合目的的分层生态毒性测试电池，以及确定研究计划的提交前会议，这些步骤将把有前景的设计转化为可部署的、符合监管要求的工具。