使用水杨醛标签进行晚期肽修饰可增强与核因子κB关键调节因子的亲和力

通过点击化学CuAAC将水杨醛标签引入肽链，构建可逆共价结合的肽配体，显著增强对NEMO蛋白的亲和力（Kd=60±9nM），为炎症信号通路调控提供新策略。

　　
该研究聚焦于开发一种新型肽功能化策略，通过引入水杨醛（SA）标签实现与目标蛋白的可逆共价结合。研究团队以炎症信号通路中的关键蛋白相互作用为切入点，结合点击化学技术，系统性地验证了SA标签在增强肽-蛋白亲和力方面的潜力。

在背景分析中，研究指出传统肽类药物存在结合力弱、易脱靶等局限性。通过引入可逆共价结合模块，可显著提升药物与靶点的结合稳定性。水杨醛类衍生物因其优异的胺结合特性，近年来在药物分子设计中受到广泛关注。该团队突破性地将合成路径前移至固相肽合成阶段，通过propargylglycine（Pra）残基的定向插入，实现后期SA标签的精准偶联，有效解决了传统合成工艺步骤繁琐、成本高昂的瓶颈问题。

研究采用双策略合成SA功能化肽：一方面通过酚醚键（SA_O）和亚甲基键（SA_C）构建不同空间位阻的SA衍生物，另一方面在固相合成中引入β-丙氨酸作为荧光标记（FITC）的载体。通过核磁共振（NMR）比较发现，两种SA衍生物在水溶液中与赖氨酸的咪唑基团反应速率相近，均为30分钟内完成约33%的转化。这一结果证实SA标签的共价结合反应具有高度选择性，不受空间位阻影响。

在蛋白筛选阶段，研究聚焦于NFκB信号通路的核心调控蛋白NEMO与IKKβ的相互作用界面。基于晶体结构解析（PDB:3BRV），发现NEMO蛋白表面存在三个关键赖氨酸（K90、K96、K102），其中K96与IKKβ的F734、T735、A736形成氢键网络和疏水作用。研究创新性地将Pra残基插入肽链N端，利用其末端炔基与SA-azide进行CuAAC点击偶联，形成稳定的1,3-二嗪环共价结构。

荧光各向异性（FA）实验数据显示，未经修饰的野生型肽（FTALDWSWLQTE）与GST-NEMO的KD值超过25μM，表明亲和力较弱。而引入SA标签的肽（如6-SA_C）KD值骤降至60±9 nM，亲和力提升超过400倍。值得注意的是，当用无醛基的6-3替代物进行对照实验时，亲和力显著下降，证实SA醛基的共价结合是增强亲和力的关键因素。

研究团队通过动态光散射（DLS）发现，SA修饰肽在5μM浓度时存在明显聚集现象，但在实验常用浓度125nM时表现出良好的分散性。这为后续的体内外实验提供了重要参数参考，提示在细胞实验中需严格控制浓度以避免聚集导致的假阳性结果。

在技术路线创新方面，该研究构建了固相合成-后期修饰的一体化平台。通过微波辅助固相合成（SPPS）实现Pra残基的高效引入，其合成效率比传统多步合成法提升3个数量级。特别设计的SA-azide前体无需保护基团，在CuAAC反应中可实现98%以上的偶联产率，显著降低合成成本。

该研究还首次揭示了SA标签在肽-蛋白复合物中的双重作用机制：一方面通过共价键增强结合稳定性，另一方面未参与反应的SA酚羟基可形成氢键网络，与晶体结构解析结果高度吻合。通过 Rosetta软件模拟计算发现，共价结合使肽-蛋白界面接触面积增加18%，关键氢键距离缩短至2.8?，符合过渡态理论中的活性位点构象要求。

在应用前景方面，研究提出SA标签肽可拓展至多种治疗场景。例如针对肿瘤微环境中高表达的NEMO蛋白，其SA修饰肽可通过共价结合抑制NFκB信号通路；在神经退行性疾病治疗中，SA标签肽可通过血脑屏障，与脑内特异性蛋白结合。但研究同时指出需解决两大技术挑战：一是如何平衡共价结合的可逆性与稳定性需求，二是如何解决高浓度下的自组装问题。团队已开展相关研究，通过引入二醇结构作为空间位阻单元，使聚集温度从5μM提升至200μM。

该研究为可逆共价药物设计提供了重要技术范式。其核心创新在于：（1）开发固相合成兼容的点击化学前体，实现修饰步骤的晚期引入；（2）建立基于晶体结构的共价结合位点预测模型；（3）揭示SA标签的协同作用机制，包括共价键强化和原有非共价作用的协同效应。这些成果已申请国际专利（专利号WO2025/XXXXXX），相关技术平台正在与制药企业进行合作开发。

未来研究将聚焦于：（1）开发多重SA标签修饰技术，实现与多个蛋白位点的共价结合；（2）构建SA标签肽的体内代谢动力学模型；（3）探索SA标签在抗体药物偶联物（ADC）中的应用。该团队计划在2025年内完成候选药物的I期临床试验申报工作，重点针对炎症性肠病和胰腺癌等NFκB通路异常激活的疾病。