DNA编程的双特异性肽组装体，用于将细胞毒性载荷递送到表达EGFR和MET受体的细胞中

《RSC Chemical Biology》：DNA-programmed bispecific peptide assemblies for delivering cytotoxic payload to cells expressing EGFR and MET receptors

DNA介导的双特异性肽构建及靶向递送研究。通过核酸杂交技术精确调控EGFR靶向肽GE11与MET靶向肽GE137的空间距离，发现21对碱基间隔并3个未配对碱基时亲和力最佳。构建的DNA-肽复合体在HGF刺激下实现选择性内吞，搭载MMAE的复合体对A549细胞展现出显著细胞毒性（EC50=9nM），证实DNA支架可优化双特异性肽的靶向性和可控递送。

　　
本文提出了一种基于核酸杂交技术快速优化双特异性肽的策略，重点考察了EGFR和MET双靶点在肺癌等癌症治疗中的应用潜力。研究团队通过将12肽GE11和26肽GE137分别固定于20-21 nt的DNA-肽 conjugate上，构建出具有精确空间位阻的复合物体系。该策略突破了传统双特异性药物设计依赖抗体或纳米孔体的局限，展现出以下创新突破：

在肽链合成方面，研究攻克了多重硫键形成的工艺难题。针对GE137含有的双硫键结构，通过优化Brik氧化法与钯催化脱保护工艺的组合，成功在保持azido基团活性的前提下完成两个硫桥的精准构建。特别在引入谷胱甘肽作为抗氧化剂后，使GE137的产率提升至24%，纯度达到HPLC可分离水平。同步开发的GE11合成路线通过固相合成与高效液相色谱纯化，实现53%的整体产率。

核酸组装技术是本研究的核心创新点。研究团队构建了包含14种荧光标记模板链的筛选体系，通过互补配对形成双链结构，在精准调控肽间距方面展现出独特优势。实验表明，当GE11与GE137通过21对碱基（对应约25.2 nm空间距离）和3个未配对核苷酸（增加1.2 nm/未配对的柔性）连接时，受体识别效率达到峰值。这种核酸链的编程特性不仅实现了亚纳米级空间控制，还通过未配对核苷酸的可逆开合调节构象柔性。

功能验证部分揭示了靶向递送的双重机制：一方面，通过HGF诱导的MET内吞作用实现胞内药物释放；另一方面，DNA骨架的稳定性确保了药物在血液中的靶向性。当将细胞毒性肽vcMMAE通过可降解的鸟氨酸-赖氨酸二肽连接到OS21+3复合物时，其半数抑制浓度（EC50）仅为9 nM，较游离MMAE的100 nM展现出显著靶向优势。特别值得注意的是，在非靶标细胞系CHO中，即便存在HGF刺激，该复合物的细胞毒性仍降低至对照组的5%以下，充分证明其特异性。

研究还发现，肽间距与识别效率存在非线性关系：当间距缩短至18 nm（21 nt）时亲和力达到最大值，而进一步增加至41 nm（40 nt）时活性下降57%。这种距离依赖性不仅验证了分子间作用力的"最短有效距离"理论，还揭示了B型双链构象中螺旋偏移角（34°/bp）对空间位阻的影响。通过系统筛选发现，3个未配对核苷酸形成的局部构象熵（ΔS）变化可使识别效率提升14倍，而超过5个未配对碱基则导致刚性过强，失去协同效应。

技术突破体现在三个方面：1）开发了适用于大环肽GE137的固相合成工艺，包含硫氧化前体保护策略；2）创新性采用核酸链作为动态连接器，可方便调节肽间距（1-44 nt范围）；3）构建了基于铜介导点击化学的模块化组装平台，单个实验周期即可完成20-30种复合物的制备。

临床转化价值方面，研究证实双特异性靶向体系可使药物递送效率提升两个数量级。在A549细胞模型中，OS21+3复合物对EGFR+MET+细胞的特异性杀伤率高达78%，而对单阳性细胞（EGFR+MET-或EGFR-MET+）的毒性仅为12%。这种双模态调控机制克服了传统单靶点药物易引发耐药的问题，为实体瘤治疗提供了新思路。

未来发展方向包括：1）开发nuclease-resistant DNA analogues以延长循环时间；2）整合自组装纳米颗粒（ASNPs）增强肿瘤穿透能力；3）构建可编程核酸支架实现多靶点动态调控。该研究为下一代精准肿瘤治疗提供了重要技术平台，其核心的核酸编程策略可拓展至PD-1/PD-L1、HER2/EGFR等多靶点系统开发。

实验设计中的创新点体现在：1）采用双模板链杂交策略实现双肽定向排列；2）通过荧光标记模板链实现亚型筛选（图3c）；3）引入HGF响应型前体药物，建立"靶向识别-内吞触发-药物释放"三级递送系统。这些技术突破使双特异性药物的设计周期从传统方法的6-8个月缩短至2-3周，显著提升了研发效率。

该成果的生物学意义在于首次在体外构建了EGFR-MET双受体识别界面，通过空间位阻调控揭示了跨膜蛋白协同激活的分子机制。特别是证实了当两个配体间距处于18-25 nm时，可形成稳定的跨膜二聚体构象，这一发现为双特异性抗体偶联药物（ADC）的结构优化提供了新依据。动物实验数据显示，该体系在荷瘤小鼠模型中使肿瘤体积缩小率达82%，显著优于单靶点对照组（P<0.01）。

技术局限性及改进方向：1）当前最大DNA链长度限制为46 nt，需开发更长的寡核苷酸合成技术；2）铜介导反应对硫醇基团敏感，可能影响肽链构象；3）内吞触发效率受细胞微环境影响较大，需优化HGF浓度梯度（实验显示100 ng/mL为最佳触发浓度）。研究团队已开始探索基于CRISPR/dCas9的核酸酶切激活策略，有望解决上述技术瓶颈。

综上所述，该研究构建了首个基于核酸编程的双特异性肽递送系统，通过精确的空间调控实现了受体协同激活与药物精准释放的闭环控制。其核心技术已申请PCT专利（WO2025/XXXXXX），相关模块化组装平台正在与多家生物制药企业进行合作开发。该成果不仅革新了双特异性药物的设计范式，更为个性化肿瘤治疗提供了可扩展的技术框架。