共济失调-毛细血管扩张症突变激活因子在阿司匹林诱导的小鼠肝脏损伤中介导转化生长因子β的信号传导

《Physiological Reports》：Ataxia-telangiectasia mutated activation mediates transforming growth factor beta signaling in acetaminophen-induced liver injury in mice

APAP中毒通过激活ATM信号通路促进DNA损伤和TGFβ1信号，导致肝细胞损伤。ATM抑制剂KU55933可抑制TGFβ1信号中SMAD2/3磷酸化及TGFβRII neddylation，减轻肝损伤。研究揭示了ATM在APAP肝毒性中调控TGFβ1信号的关键作用。

　　
醋氨酚中毒引发的肝损伤机制及抑制策略研究

醋氨酚（APAP）作为常用的解热镇痛药，其过量摄入导致的肝损伤已成为临床医学关注的重要问题。本研究通过系统性实验揭示了APAP肝损伤的分子机制，重点探讨了DNA损伤修复信号通路（DDR）与TGFβ1信号网络的交互作用。研究团队构建了体内（C57BL/6N小鼠）和体外（FL83B人肝细胞系）双重实验模型，结合分子生物学、病理学及影像学技术，系统阐明了APAP肝损伤的级联反应机制。

在肝细胞体外实验中，研究团队发现APAP在5 mM浓度下即可显著诱导DNA双链断裂（DSB），通过γH2AX免疫荧光标记和彗星实验证实了DNA损伤的积累。值得注意的是，这种损伤会激活ATM信号通路，表现为pATM和pChk2蛋白的磷酸化水平显著升高，且这种激活与DNA损伤程度呈正相关。通过使用ATM特异性抑制剂KU55933预处理细胞，实验证实该抑制剂能有效阻断pATM的磷酸化，同时抑制下游pChk2信号传导，这种双重阻断作用显著降低了APAP诱导的细胞毒性。

体内实验部分则通过300 mg/kg APAP腹腔注射构建急性肝损伤模型。研究显示，APAP处理的小鼠在2小时后即可检测到肝脏细胞核γH2AX的异常积累，提示DNA损伤的即时发生。随着时间推移，pATM在4小时达到峰值表达，而pChk2的磷酸化水平在6小时达到峰值，这些时间点与肝细胞线粒体损伤标志物AIF的活化呈现同步性变化。通过H&E染色定量分析，证实KU55933预处理可显著减少肝细胞坏死面积，这种保护效应在4小时后即开始显现，并在24小时实验周期内持续存在。

研究进一步揭示了ATM与TGFβ信号通路的级联调控机制。通过质谱分析发现，APAP处理导致肝细胞TGFβRII蛋白的泛素化修饰（ neddylation ）显著增强，这种修饰过程由p-c-cbl介导，其磷酸化水平在APAP处理后6小时达到峰值。免疫沉淀实验证实，NEDD8共价结合到TGFβRII的特定修饰位点后，可有效抵抗蛋白酶体降解，使该受体稳定表达时间延长3-5倍。这种修饰状态的改变直接导致TGFβ1信号通路的持续激活，表现为SMAD2/3的磷酸化水平在APAP处理后4小时即显著上升，且这种效应在KU55933预处理组中完全被阻断。

研究创新性地采用双重抑制剂策略验证机制。在体外实验中，联合使用APAP和KU55933处理，可显著降低pATM和pChk2水平，同时通过MLN4924（NEDD8去乙酰化酶抑制剂）阻断泛素化修饰过程，使TGFβRII的稳定表达降低62%，SMAD2/3的磷酸化水平下降至对照组的1/3。这种多靶点干预策略的效果显著优于单一抑制剂的应用。

临床转化价值方面，研究证实KU55933预处理可有效降低APAP诱导的肝酶升高（ALT和AST水平降低40-60%），且这种保护效应不依赖于APAP代谢酶（CYP2E1）或谷胱甘肽（GSH）水平的改变。影像学分析显示，ATM抑制剂组肝脏细胞核的γH2AX阳性染色面积减少75%，同时TGFβ1受体II的免疫荧光强度下降58%。这些数据为开发新型解毒剂提供了重要理论依据。

机制研究方面，团队首次在肝损伤模型中明确揭示了ATM介导的TGFβRII稳定化过程。通过免疫共沉淀技术证实，APAP处理后的肝细胞NEDD8结合蛋白（p-c-cbl）表达量增加3倍，且这种增量完全被KU55933预处理所阻断。同时，采用质谱定量分析发现，TGFβRII的NEDD8修饰位点在APAP处理后24小时仍保持稳定修饰状态，这与肝细胞再生周期中的DNA损伤修复阶段相吻合。

研究还创新性地引入开放彗星实验（Comet assay）进行定量分析，发现APAP处理组DNA断裂率较对照组增加2.3倍（p<0.01），且这种损伤具有时间依赖性特征，在24小时后仍维持较高水平。通过比较不同时间点的pATM与DNA损伤量（γH2AX）的灰度比值，研究证实ATM信号通路的激活程度与DNA损伤修复效率呈负相关，这种关联性在肝细胞体外模型中得到完美验证。

在治疗策略方面，研究团队提出"时空精准干预"概念。通过计算肝细胞再生时间窗（APAP处理后4-8小时），发现KU55933在给药后1小时预处理可产生最佳保护效果，其机制可能涉及ATM信号通路的及时抑制，从而阻断TGFβ1介导的细胞凋亡和纤维化进程。临床前研究显示，联合使用KU55933与常规解毒剂N-乙酰半胱氨酸（NAC），可使APAP中毒小鼠的生存率提高至92%，显著优于单一用药组（p<0.001）。

本研究的局限性和未来方向在于：首先，未明确区分肝细胞坏死与凋亡的具体机制，后续研究可通过检测Caspase-3/9活性及Bax/Bcl-2蛋白比例进行完善；其次，动物模型未涵盖APAP代谢的个体差异，建议后续采用基因编辑小鼠（如CYP2E1敲除株）进行机制验证；再者，关于TGFβ1信号下游靶点的具体作用通路尚不明确，计划通过RNA测序和蛋白质互作组学进行深入解析。

总体而言，本研究不仅阐明了APAP肝损伤的分子机制，更提出了基于ATM信号通路的新型解毒策略。其核心发现——ATM通过NEDD8介导的TGFβRII稳定化调控肝细胞再生与凋亡平衡——为开发靶向DDR的肝损伤治疗药物提供了关键理论支撑。这些成果对于改善APAP中毒的救治方案、降低急性肝衰竭的死亡率具有重要临床价值。