CAMSAP3下调通过细胞骨架重塑驱动非小细胞肺癌奥希替尼耐药的新机制

《Cell Death & Disease》：Cytoskeletal remodeling via CAMSAP3 downregulation drives resistance to osimertinib in NSCLC cells

本研究针对奥希替尼(Osimertinib)治疗非小细胞肺癌(NSCLC)产生获得性耐药的关键科学问题，首次揭示了微管结合蛋白CAMSAP3通过调控微管形态重塑和EGFR内吞循环，影响奥希替尼敏感性的新机制。研究人员发现耐药细胞中CAMSAP3表达下调导致中心体微管聚集，进而改变EGFR/pEGFR(Y1068)的溶酶体降解途径，为克服EGFR-TKI耐药提供了新的治疗靶点和联合治疗策略（奥希替尼+氯喹）。

　　

随着精准医疗的发展，表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）为携带特定EGFR突变（如19号外显子缺失和L858R突变）的非小细胞肺癌（NSCLC）患者带来了革命性的治疗突破。奥希替尼（Osimertinib，AZD9291）作为第三代EGFR-TKI，能有效抑制包括T790M耐药突变在内的EGFR信号，已成为EGFR突变NSCLC的一线治疗选择。然而，与所有靶向药物一样，获得性耐药的出现几乎不可避免，成为临床上面临的重大挑战。尽管部分耐药机制已被阐明，如C797S突变、MET扩增等，但仍有约40%的患者耐药机制不明，探索新的耐药机制迫在眉睫。

以往研究多聚焦于EGFR基因本身的二次突变或旁路激活，而西安交通大学刘华栋和龙建刚团队则将目光投向了细胞内部更为基础的结构——细胞骨架，特别是微管系统。微管作为细胞内重要的“运输轨道”，参与调控包括EGFR在内的多种膜蛋白的内吞、循环和降解过程。已有证据表明，微管相关的运输过程可能与TKI耐药相关，但其在奥希替尼耐药中的具体作用和调控机制尚不清晰。为了解决这一问题，研究人员在《Cell Death & Disease》上发表了他们的最新研究成果，揭示了微管结合蛋白CAMSAP3通过重塑细胞骨架驱动奥希替尼耐药的新机制。

本研究主要运用了细胞生物学和分子生物学的经典技术方法。研究人员首先建立了奥希替尼耐药的H1975（H1975OR）和HCC827（HCC827OR）非小细胞肺癌细胞系。通过免疫荧光染色、蛋白质印迹（Western blot）和定量实时PCR（qRT-PCR）等技术分析微管形态和相关基因表达。利用小干扰RNA（siRNA）和短发夹RNA（shRNA）进行基因敲低，以及质粒转染进行基因过表达，以验证CAMSAP3的功能。通过MTT法和结晶紫染色法评估细胞活性和药物敏感性。采用免疫共定位和LysoSensor探针等技术研究EGFR的亚细胞定位和溶酶体功能。最后，通过小鼠异种移植瘤模型在体内验证CAMSAP3敲低对奥希替尼疗效的影响。

微管重塑伴随NSCLC细胞奥希替尼耐药

研究人员首先比较了奥希替尼敏感（H1975）和耐药（H1975OR）细胞中的微管形态。β-微管蛋白（β-tubulin）免疫荧光染色显示，耐药细胞出现了独特的近核区微管簇状聚集，而敏感细胞的微管则均匀分布在细胞质中。使用微管解聚药物诺考达唑（nocodazole）处理并洗脱后，敏感细胞的微管在60分钟后分散到胞质中，而耐药细胞的微管仍锚定在微管组织中心（MTOC）。共染色证实这些簇状结构是中心体微管，表明耐药细胞中中心体微管比例显著增加。进一步的药物敏感性实验发现，耐药细胞对微管靶向药物（诺考达唑和紫杉醇paclitaxel）更为敏感。基因表达谱分析发现，在众多微管相关基因中，CAMSAP3的mRNA水平在耐药细胞中下降了近60%，提示其可能是调控这一形态变化的关键分子。

CAMSAP3促进NSCLC奥希替尼耐药

蛋白质水平检测证实，H1975OR细胞中CAMSAP3蛋白表达显著降低。临床数据分析显示，CAMSAP3低表达的肺腺癌患者总生存期更短，提示其具有预后价值。亚细胞定位显示，在敏感细胞中，CAMSAP3均匀分布在核周，与主要的非中心体微管组织模式一致；而在耐药细胞中，CAMSAP3表达减少，微管呈现中心体簇状聚集。这表明CAMSAP3的下调与耐药细胞中微管形态的改变密切相关。

CAMSAP3调控奥希替尼敏感性和微管形态

为了验证CAMSAP3的功能，研究人员在敏感细胞中敲低CAMSAP3。结果发现，敲低CAMSAP3成功地在敏感细胞中“复制”了耐药细胞的表型：出现了中心体微管簇状聚集，并且细胞对奥希替尼的敏感性下降，存活率增加。小鼠体内实验进一步证实，敲低CAMSAP3的移植瘤对奥希替尼的治疗反应显著差于对照组，肿瘤体积抑制率降低。为了确定CAMSAP3的哪个功能域起关键作用，研究人员在耐药细胞中过表达了全长CAMSAP3（CAMSAP3-FL）及其不同的截短体。只有全长CAMSAP3能够部分恢复非中心体微管的分布，并部分恢复耐药细胞对奥希替尼的敏感性，而缺失CH或HCKK结构域的截短体则无此效果，其中HCKK结构域对于CAMSAP3的正确定位至关重要。

CAMSAP3破坏溶酶体和EGFR的定位

EGFR的降解失调是耐药的重要机制。研究人员发现，在敏感细胞中，早期内体（标记物EEA1）、循环内体（标记物RAB11A）和溶酶体（标记物LAMP1）均匀分布在细胞质中；而在耐药细胞和CAMSAP3敲低细胞中，这些细胞器均聚集在近核MTOC区域。蛋白质印迹显示RAB11A水平降低而LAMP1水平升高，提示内体-溶酶体运输发生改变。令人意外的是，通常难以降解的突变型EGFR和磷酸化EGFR（pEGFR(Y¹⁰⁶⁸)）在耐药细胞和CAMSAP3敲低细胞中的表达水平反而显著降低。共定位实验表明，pEGFR与LAMP1的共定位增强，且溶酶体酸性增加，说明CAMSAP3的缺失促进了突变型EGFR的溶酶体降解。使用溶酶体抑制剂氯喹（Chloroquine, CQ）处理，可以阻止CAMSAP3敲低引起的EGFR降解。功能实验表明，CQ与奥希替尼联用，在体外和体内均能更有效地抑制耐药细胞的生长。

对EGFR/pEGFR的定位分析显示，在敏感细胞中，它们主要定位于细胞膜；而在耐药细胞和CAMSAP3敲低细胞中，它们积累在近核MTOC区域，表达水平降低。持续奥希替尼处理后，耐药细胞中几乎检测不到pEGFR。这些结果证实，CAMSAP3的缺失通过改变微管网络，将EGFR/pEGFR从膜循环途径“劫持”至溶酶体降解途径，从而导致其消耗。然而，EGFR的转录水平并未改变，说明这种消耗是翻译后降解的结果。

本研究首次系统地阐明了CAMSAP3在奥希替尼耐药中的核心作用。研究结论表明，CAMSAP3的下调是驱动奥希替尼耐药的一个主动因素，而非伴随现象。其机制在于：CAMSAP3缺失导致微管形态重塑，从非中心体为主转变为以中心体微管聚集为主；这种细胞骨架的改变进而破坏了正常的内体-溶酶体运输系统，使得原本应循环至细胞膜的突变EGFR被错误地导向溶酶体进行降解。这看似矛盾地消耗了EGFR，实则使肿瘤细胞摆脱了对EGFR信号的依赖，从而在奥希替尼的压力下得以存活和增殖。

这一发现具有重要的理论和临床意义。在理论层面，它揭示了细胞骨架重塑是肿瘤细胞产生靶向药物耐药的一种非遗传性新机制，拓宽了对耐药机制的理解。在临床转化层面，研究提示CAMSAP3的表达水平可能作为预测奥希替尼疗效的生物标志物。更重要的是，研究发现耐药细胞对微管稳定剂（紫杉醇）和溶酶体抑制剂（氯喹）更为敏感，这为克服奥希替尼耐药提供了新的联合治疗思路：即奥希替尼联合紫杉醇和/或氯喹，可能成为治疗CAMSAP3低表达NSCLC患者的合理策略。未来利用组学技术进一步深入探索CAMSAP3介导的耐药网络，将有望发现更多有价值的干预靶点。