miR-299a-5p通过调控卵泡抑素和Cripto-1介导糖尿病肾病纤维化

《Communications Biology》：miR-299a-5p is a mediator of fibrosis in diabetic kidney disease by regulating follistatin and cripto-1

本刊推荐：糖尿病肾病（DKD）是终末期肾病的主要病因，现有疗法难以阻断其进展。本研究聚焦于microRNA-299a-5p在DKD纤维化中的作用机制，发现其通过抑制抗纤维化蛋白卵泡抑素（FST）和Cripto-1的表达，增强激活素A（actA）和TGF-β1信号通路，从而促进细胞外基质积聚。抑制miR-299a-5p可显著改善小鼠DKD模型肾纤维化，为DKD治疗提供了新的潜在靶点。

　　

糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease, DKD）是糖尿病最常见且严重的并发症之一，约40%的糖尿病患者会发展为DKD，它已成为导致终末期肾病（End-Stage Renal Disease, ESRD）的首要原因，严重降低患者生活质量并增加死亡风险。尽管目前临床通过控制血糖、血压以及使用肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）抑制剂和钠-葡萄糖协同转运蛋白-2（SGLT2）抑制剂等综合手段治疗DKD，但这些方法仍无法有效阻止疾病进展。因此，探寻新的治疗靶点以遏制DKD恶化是当前肾脏病研究领域的迫切需求。

DKD的早期病理改变主要发生在肾小球，表现为基底膜增厚和系膜区细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）蛋白的异常积聚。转化生长因子-β₁（Transforming Growth Factor-β₁, TGF-β₁）是公认的促纤维化关键因子，但其生物学功能的多样性使得直接靶向TGF-β₁的治疗策略面临巨大挑战。先前的研究发现，TGF-β₁可通过上调microRNA-299a-5p（miR-299a-5p）来抑制肾脏系膜细胞（Mesangial Cells, MC）中抗纤维化蛋白卵泡抑素（Follistatin, FST）的表达。FST能够强效中和激活素A（Activin A, actA）和激活素B（Activin B, actB），而actA在DKD纤维化中起重要作用。虽然外源性FST能够减轻高糖（High Glucose, HG）诱导的ECM产生，并在DKD动物模型中显示出抗纤维化效果，但其有效剂量范围较窄，限制了临床应用。因此，通过调控内源性FST的表达可能成为更安全有效的治疗策略。

miR-299a-5p属于miR-154家族，该家族是人体内第二大miRNA簇，成员超过40个，且在物种间高度保守。已有研究表明，该家族成员在肺纤维化、心脏纤维化和肝纤维化等疾病中表达异常并参与纤维化进程。然而，miR-299a-5p是否在DKD中发挥重要作用尚不清楚。本研究系统探讨了miR-299a-5p在DKD纤维化中的功能及其分子机制，相关成果发表于《Communications Biology》。

为开展本研究，研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞层面，使用原代小鼠系膜细胞进行培养，并通过质粒转染实现miR-299a-5p的过表达或抑制；利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-299a-5p与靶基因3'非翻译区（3'UTR）的结合；通过蛋白质印迹（Western Blot）、实时定量PCR（qPCR）和免疫组织化学（IHC）等技术检测基因和蛋白表达。在动物模型方面，研究采用了两种1型糖尿病小鼠模型：链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）诱导的CD1小鼠和Akita（Ins2突变）小鼠，以及过表达TGF-β₁的Akita小鼠（HH-A模型）；通过锁核酸（Locked Nucleic Acid, LNA）修饰的anti-miR进行体内抑制实验；评估了肾功能指标（肾小球滤过率、尿白蛋白/肌酐比值）、肾脏组织学（纤维化染色、免疫组化）和信号通路活性（Smad3磷酸化）。人源样本包括DKD患者肾活检组织和癌旁正常肾组织（经伦理委员会批准）。

研究结果

miR-299a-5p在糖尿病肾脏和系膜细胞中表达上调

研究人员首先发现，高糖（30 mM）处理可显著上调原代小鼠系膜细胞中miR-299a-5p的表达，而渗透压对照物甘露醇无此效应。在两种1型糖尿病小鼠模型（STZ诱导的CD1小鼠和Akita小鼠）的肾皮质以及人类2型糖尿病DKD患者的肾活检组织中，miR-299a-5p的表达均显著升高。原位杂交（ISH）显示，miR-299a-5p在肾小球和肾小管中均有表达，提示其可能在不同肾脏细胞类型中均发挥作用。

miR-299a-5p促进高糖诱导的促纤维化反应

功能实验表明，抑制miR-299a-5p可显著减轻高糖诱导的系膜细胞ECM蛋白（如纤维连接蛋白、胶原蛋白Iα1）和促纤维化因子（结缔组织生长因子，CTGF）的表达，并抑制胶原蛋白Iα1启动子的活性。相反，过表达miR-299a-5p则能模拟高糖的效应，显著增强基础的ECM产生和Smad3信号通路的活化（表现为Smad3 C末端磷酸化及其转录活性增加）。这些结果证实miR-299a-5p是高糖促纤维化反应的关键介质。

miR-299a-5p抑制抗纤维化蛋白Cripto-1和FST的表达

通过生物信息学分析，研究人员预测并证实了Cripto-1（又名TDGF1）是miR-299a-5p的另一个直接靶标。Cripto-1的3'UTR存在保守的miR-299a-5p应答元件（MRE）。高糖处理或miR-299a-5p过表达均可降低Cripto-1 3'UTR报告基因的活性，并下调Cripto-1的mRNA和蛋白水平。同时，FST的表达也受到相同调控。在糖尿病小鼠肾脏和人类DKD样本中，Cripto-1和FST的蛋白表达均显著降低。这表明，高糖通过上调miR-299a-5p，同时抑制了Cripto-1和FST这两个抗纤维化蛋白的表达。

Cripto-1抑制高糖诱导的促纤维化信号

功能获得性实验显示，重组Cripto-1蛋白能够抑制高糖或miR-299a-5p过表达所诱导的Smad3磷酸化、转录活性以及ECM蛋白的合成。值得注意的是，Cripto-1不仅能抑制actA的信号（与FST类似），还能抑制TGF-β₁的信号传导。中和抗体实验进一步表明，miR-299a-5p过表达所促发的纤维化反应主要依赖于actA和TGF-β₁，而非actB。将Cripto-1与FST联合使用时，对Smad3活性和胶原蛋白产生的抑制作用显示出协同效应，提示同时靶向actA和TGF-β₁可能比单独抑制任一通路更具治疗潜力。

Caveolin-1缺失通过下调miR-299a-5p上调Cripto-1和FST

此前研究发现，缺乏小窝蛋白-1（Caveolin-1）的系膜细胞其纤维化反应减弱，且FST表达上调与miR-299a-5p活性降低有关。本研究进一步发现，Caveolin-1敲除（KO）的系膜细胞中Cripto-1的表达也显著升高，并且这种上调可被miR-299a-5p过表达所逆转。这为Caveolin-1缺失对DKD的保护作用提供了新的机制解释。

抑制miR-299a-5p改善糖尿病肾病进展

在体实验表明，使用LNA-anti-miR抑制miR-299a-5p，可显著改善过表达TGF-β₁的Akita（HH-A）糖尿病小鼠的肾脏病变。抑制miR-299a-5p恢复了肾脏中Cripto-1和FST的蛋白水平，降低了尿白蛋白排泄率和肾小球肥大，并改善了足细胞标志物nephrin的丢失。组织学分析显示，肾脏纤维化（胶原沉积、纤维连接蛋白、CTGF表达）明显减轻。同时，肾脏中活化的Smad3、actA以及尿中actA和TGF-β₁的水平均显著下降。此外，糖尿病小鼠血清中miR-299a-5p水平升高，提示其可能作为DKD的潜在生物标志物。

研究结论与意义

本研究首次揭示了miR-299a-5p在DKD纤维化中的核心作用。高糖通过上调miR-299a-5p，同时抑制两个重要的内源性抗纤维化蛋白——FST和Cripto-1的表达，从而解除对actA和TGF-β₁信号通路的抑制，最终导致ECM过度积聚和肾纤维化。抑制miR-299a-5p能够"一石二鸟"，同时恢复Cripto-1和FST的水平，有效减轻糖尿病肾脏的纤维化损伤。

该研究的科学意义在于：1）阐明了miR-299a-5p/FST/Cripto-1轴是连接高糖与肾脏纤维化的重要新通路；2）提出了通过调控miRNA来恢复内源性抗纤维化蛋白表达的治疗新策略，相较于外源性补充单一蛋白或直接靶向多效性的TGF-β₁，可能具有更好的安全性和疗效；3）血清miR-299a-5p水平的升高为其作为DKD无创诊断或疾病进展监测的生物标志物提供了依据。

当然，本研究也存在一些局限性。例如，miRNA通常具有多个靶基因，未来需要使用靶点特异性阻断剂来确认miR-299a-5p的益处确实主要通过Cripto-1和FST介导。此外，研究重点在系膜细胞和肾小球纤维化，而miR-299a-5p在肾小管上皮细胞中的表达提示其可能也参与糖尿病相关的肾小管损伤和间质纤维化，这值得进一步探索。总之，靶向miR-299a-5p为开发阻止DKD进展的新疗法带来了希望。