三维与二维环境中肺腺癌细胞对机械应力响应差异的机制研究

《Communications Biology》：Lung adenocarcinoma cells respond differently to mechanical stress in 3D versus 2D environments

本研究针对传统2D培养模型难以模拟体内复杂机械微环境的问题，开发了基于去细胞化大鼠肺支架的ex vivo 3D肺癌模型。通过模拟呼吸运动（RM）和血流灌注，发现RM在3D环境中通过整合素β1/β-连环蛋白/YAP信号轴显著促进细胞粘附增殖，而在2D环境中则抑制增殖并诱导凋亡。该研究揭示了维度依赖性机械传感机制，为肺癌生物学研究提供了更接近生理状态的模型系统。

　　

在肺癌研究领域，科学家们长期依赖二维（2D）培养模型来探索癌细胞的生物学行为。然而，这种在平坦塑料表面生长细胞的方式，与人体内复杂的三维（3D）环境相去甚远。尤其是在肺部，癌细胞时刻经历着呼吸运动（Respiratory Motion, RM）带来的周期性拉伸和血液流动产生的剪切应力。这些机械力信号如何影响癌细胞的命运？在简单的2D培养皿中得到的结论，能否真实反映体内情况？这些问题一直困扰着研究人员。传统2D模型的局限性日益凸显，它无法模拟细胞与细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）的复杂相互作用，也难以重现组织特有的软硬度。因此，开发能够更好模拟体内机械微环境的3D模型，对于准确理解肺癌进展机制至关重要。

为了解决这一难题，来自日本富山大学的研究团队在《Communications Biology》上发表了一项创新性研究。他们成功构建了一种ex vivo（离体）3D肺癌模型，将人类肺腺癌细胞种植到经过特殊处理的大鼠去细胞化肺支架中，并将其置于能够精确模拟呼吸运动和血液灌注的生物反应器内进行培养。通过系统比较3D模型与传统2D培养条件下癌细胞对机械应力的响应差异，研究人员揭示了维度环境在细胞机械传感中的关键作用。

为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键技术方法。首先，他们从Sprague-Dawley大鼠获取心肺组织块，通过灌注洗涤剂和酶溶液进行去细胞化处理，得到保留天然ECM结构的肺支架。其次，研究团队自主设计了压力刺激单元（Pressure Stimulation Unit, PSU）和血压单元（Blood Pressure Unit, BPU）组成的生物反应器系统，能够同时控制腔内压力（模拟呼吸运动）和血管灌注压力。第三，他们通过气道播种方式将A549人肺腺癌细胞接种到去细胞化肺支架中进行再细胞化。最后，研究采用组织学染色、免疫荧光、RNA测序和qRT-PCR等多种技术手段，从细胞形态、蛋白表达到基因水平全面评估机械应力对癌细胞的影响。

研究结果部分，从以下几个方面展示了详细发现：

2D细胞培养使用压力舱

在2D培养条件下，模拟呼吸运动（RM⁺组）反而抑制了细胞增殖，与静态培养（RM^-组）相比，附着细胞数量显著减少（5.74±1.97×10⁵vs 12.90±1.21×10⁵）。RM⁺组的细胞凋亡指标cleaved caspase-3阳性细胞比例显著升高（25.07±11.59% vs 8.07±4.27%），而细胞增殖标志物Ki-67（MIB-1指数）则明显降低。值得注意的是，机械敏感蛋白YAP（Yes-associated protein）在两组的核定位无显著差异，β-连环蛋白（β-catenin）均未出现核转位。这些结果表明，在缺乏ECM支持的2D刚性基底上，呼吸运动更像是一种应激源，而非激活信号通路的生理性刺激。

3D细胞培养使用压力舱和灌注系统

与2D结果形成鲜明对比的是，在3D培养模型中，RM⁺组表现出显著的细胞行为改变。宏观观察显示，RM⁺组肺部出现大面积白色区域，组织学检测证实为广泛的细胞粘附，粘附率显著高于RM^-组（33.13±4.29% vs 13.60±8.14%）。RM⁺组的细胞增殖活性明显增强，MIB-1指数达到71.92±18.72%，而凋亡指标在两组间无差异。更重要的是，RM⁺组中YAP和β-连环蛋白的核转位比例显著增加，同时整合素β1（integrin β1）表达和E-钙黏蛋白（E-cadherin）荧光强度也明显上调。免疫荧光双标染色进一步显示，RM⁺组中整合素β1与胶原蛋白I（collagen I）、纤维连接蛋白（fibronectin）的共定位增强，表明细胞-ECM粘附结构更加稳固。

RNA测序和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）

基因表达分析揭示了维度环境对机械应力响应的根本性差异。在2D培养中，RM⁺组上调的是CDKN1A、NR4A3等肿瘤抑制基因，下调的是CA9、EFNA1等促癌基因，GO分析显示与细胞增殖负调控相关的通路富集。而在3D环境中，RM⁺组上调的是INHBA、LOX、LRRC15、CXCL12等与细胞增殖粘附相关的基因，GO分析显示"细胞外空间"、"细胞-细胞粘附蛋白复合物"等类别显著富集。qRT-PCR验证进一步证实，仅在3D条件下，整合素β1和YAP下游靶基因CTGF（connective tissue growth factor）表达显著上调。基因集富集分析（GSEA）发现，RM⁺组中"雄激素反应"通路激活，而RM^-组中"P53通路"等应激相关通路富集。值得注意的是，二维和三维模型之间仅有一个共同差异表达基因SIK1，凸显了维度环境对细胞转录应答的深刻影响。

综合研究结果与讨论，这项工作的核心发现是：细胞对机械应力的响应高度依赖于所处的维度环境。在具备天然ECM结构的3D模型中，呼吸运动通过增强整合素β1介导的细胞-基质粘附，激活β-连环蛋白和YAP/TAZ机械传导通路，进而促进细胞增殖和组织形成。相反，在缺乏ECM支持的2D刚性基底上，相同的机械刺激反而诱导细胞应激反应，抑制增殖并促进凋亡。

这一发现具有重要的理论和实践意义。在基础研究层面，它强调了在癌症生物学研究中采用生理相关性更高模型系统的必要性，特别是对于像肺这样持续经历机械应力器官的癌症研究。在技术层面，研究所开发的ex vivo 3D模型结合机械刺激系统，为肺癌研究提供了强大平台，能够更准确地模拟肿瘤微环境中的机械力学特征。虽然目前广泛使用的3D培养技术（如水凝胶、类器官、肺芯片等）各有优势，但本研究采用的去细胞化肺支架保留了天然肺组织的复杂ECM成分和三维结构，在组织水平重现方面具有独特价值。

研究的局限性包括尚未与其他3D系统进行直接比较，差异表达基因的筛选阈值较为宽松，以及未能深入探讨机械传导的具体分子机制。未来研究可通过整合素β1阻断抗体、YAP抑制剂等功能实验验证因果关系，并考虑3D培养中氧和营养梯度等因素的影响。

总之，这项研究清晰地表明，机械环境与维度背景共同决定了肺癌细胞的生物学行为，挑战了传统2D培养得出的结论，为推动肺癌研究向更生理相关模型转变提供了有力证据。正如作者所言："准确复制机械拉伸对于理解细胞反应至关重要"，在三维环境中模拟呼吸运动是研究肺癌生物学并保持生理保真度的必要条件。