磷酸化HP1α介导异染色质相分离的分子特征：位点特异性机制及其与染色质/DNA互作研究

《Communications Biology》：Revealing site-specific molecular features mediating contacts of heterochromatin protein 1 α (HP1α) and the interactions with chromatin and DNA in LLPS environments

本研究针对磷酸化异染色质蛋白1α(pHP1α)在液-液相分离(LLPS)环境中如何介导异染色质形成的分子机制不明确的问题，通过核磁共振(NMR)、分子动力学模拟(MD)和共聚焦显微镜技术，揭示了磷酸化N端延伸区(NTE)和铰链区(hinge)驱动pHP1α自聚集的关键作用，并发现pHP1α通过其色域(CD)特异性识别H3K9me3核小体，且DNA可通过竞争性结合铰链区调控LLPS。该研究为异染色质动态组装提供了原子水平的机制见解。

　　

在真核细胞中，异染色质作为基因沉默的关键结构域，其动态组装受到多种效应蛋白和表观遗传修饰的精密调控。异染色质蛋白1（HP1）家族作为核心效应蛋白，通过形成相分离凝聚体参与异染色质的空间组织，但磷酸化修饰如何精确调控HP1α的相分离行为及其与染色质的互作机制尚不清晰。近日发表于《Communications Biology》的研究通过多尺度技术联合分析，揭示了磷酸化HP1α（pHP1α）在相分离环境中的分子作用模式，为理解异染色质动态调控提供了原子水平的新见解。

本研究综合运用核磁共振光谱（NMR）、分子动力学模拟（MD）、共聚焦显微镜和荧光漂白恢复（FRAP）技术，系统分析了pHP1α的相分离动力学及其与端粒核小体阵列、经典Widom 601核小体阵列和游离DNA的相互作用。研究团队首先通过共表达HP1α与酪蛋白激酶II（CKII）获得N端丝氨酸（S11-S14）磷酸化的pHP1α，并利用多维NMR实验解析其溶液结构。进一步通过滴定实验和分子动力学模拟，阐明了pHP1α在不同离子强度下的自聚集机制，并比较了其与不同压缩状态的染色质纤维的互作特征。

磷酸化不改变HP1α整体结构但调控其相分离能力

通过对比磷酸化与非磷酸化HP1α的二维¹H-¹⁵N HSQC谱图，研究发现磷酸化并未显著改变蛋白的整体折叠状态，但特异性影响了NTE及其邻近区域的化学环境。在KCl诱导的相分离实验中，pHP1α在低盐浓度（0-75 mM KCl）下形成动态液滴，其FRAP恢复曲线表明凝聚体具有液体流动性。NMR化学位移扰动（CSP）分析显示，磷酸化丝氨酸（pSer）、NTE中的带正电残基（K6、R7）以及铰链区的碱性残基（K69、K72等）在相分离过程中发生显著信号衰减，提示这些区域参与分子间静电相互作用。分子动力学模拟进一步验证了pSer与铰链区残基（如K84、R82）形成的盐桥是驱动pHP1α自聚集的关键力量。

pHP1α与核小体阵列的相分离由自聚集和特异性识别共同驱动

针对端粒核小体阵列（具有柱状紧凑结构）和Widom 601核小体阵列（呈现锯齿状开放构象）的对比实验表明，pHP1α可通过其CD域特异性结合H3K9me3修饰的组蛋白H3尾巴，而NTE-铰链区互作则调控染色质纤维的压缩程度。在端粒核小体阵列中，紧密堆叠的核小体使H3K9me3尾巴空间邻近，增强了pHP1α的桥接作用，导致更强的相分离信号。NMR滴定显示，CD域残基（如W41、Y20）在结合核小体后发生显著CSP变化，印证了其通过芳香笼结构与H3K9me3的阳离子-π相互作用。相比之下，开放构象的Widom 601阵列中pHP1α的自聚集作用较弱，说明染色质空间结构可调控HP1蛋白的相分离效率。

DNA通过竞争性结合铰链区调控pHP1α相分离

研究发现游离DNA可抑制pHP1α的相分离，其机制不同于野生型HP1α的DNA促进效应。NMR谱图分析表明，DNA添加后pHP1α的NTE区域出现显著CSP变化，而铰链区信号衰减较弱，提示磷酸化NTE通过占据铰链区的正电残基位点，阻断了DNA与铰链区的静电吸引。这种竞争性作用削弱了pHP1α的自聚集能力，凸显了磷酸化修饰在精确调控HP1α与核酸互作中的分子开关功能。

结论与展望

本研究系统阐明了pHP1α通过NTE-铰链区互作驱动自聚集、通过CD域识别H3K9me3核小体、并与DNA竞争性互作的分子蓝图，揭示了磷酸化修饰在相分离调控中的核心地位。特别值得注意的是，端粒染色质的独特柱状结构通过增强pHP1α的桥接效率，可能对端粒帽结构的维持具有生理意义。该工作不仅深化了对异染色质动态组装的物理化学理解，也为探索HP1家族蛋白在基因沉默、DNA损伤应答等过程中的功能差异提供了新范式。未来针对HP1β和HP1γ与核小体互作的比较研究，将进一步揭示HP1蛋白功能多样性的结构基础。