《Legal Medicine》：Mechanism of postmortem drastic increase of blood myoglobin concentration: its permeability through vascular wall
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肌红蛋白（Mb）通过血管壁扩散进入血液是死后快速血Mb升高的直接机制，实验通过兔肌肉-猪主动脉模型结合免疫组化（IHC）和ELISA证实：接触肌肉的血管外膜15分钟即出现Mb染色，5天内约16%的Mb从动脉壁扩散至腔内，静脉扩散效率显著高于主动脉，该机制为法医血Mb水平解读提供依据。
竹井诚|三浦雅信|村瀬武彦|木下宏|宫石智
冈山大学医学部、齿学部、药学部法医学系，日本冈山市北区志方2-5-1，邮编700-8558
摘要
我们首次提供了直接实验证据，证明肌红蛋白（Mb）在死亡后能够穿过血管壁并进入血液。死后血液中的Mb浓度会迅速升高；然而，迄今为止，尚未有人报告这一现象的机制。我们假设Mb直接从骨骼肌扩散到血液中是通过血管壁发生的，并通过使用动物样本的实验从形态学和生化角度证明了这一点。首先，对直接与骨骼肌接触的动脉外膜进行免疫组化（IHC）Mb染色后发现，Mb会随着时间的推移从外膜扩散到内膜。随后，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）对Mb进行定量分析，证实Mb确实会穿过血管壁进入血管腔内。为了验证这一过程，我们将动脉夹在含有或不含Mb的明胶盘之间。结果发现Mb浓度以时间依赖的方式增加，在5天内约有16%的Mb从来源部位扩散到血管腔内。当使用静脉而非主动脉进行实验时，这一速率显著增加。这些发现阐明了死后生化物质重新分布的基本机制，可能提高法医学实践中解读血液蛋白水平的可靠性。
引言
肌红蛋白（Mb）是一种含有血红素的蛋白质，分子量约为18,000道尔顿，主要存在于横纹肌中[[1], [2], [3]]。在健康个体中，外周血液中的Mb浓度很低，通常低于0.003毫克/分升[4]。临床上，Mb可作为肌肉损伤（如心肌梗死或横纹肌溶解症）的早期敏感生物标志物。在法医学实践中，死后样本中的Mb测量也被用作辅助诊断指标[[4], [5], [6], [7]]。然而，由于对相关机制和解释有效性的认识不足，死后血液Mb水平显著升高的法医学意义尚未得到充分阐明。
我们之前的法医学案例研究和对照动物实验集中在阐明Mb的死后重新分布上[8, 9]。我们证明Mb可以在死亡后从骨骼肌被动转移到邻近组织中。值得注意的是，在甲状腺等小而被肌肉包裹的器官中，Mb含量的增加非常迅速；而在肝脏等较大且不直接与肌肉接触的器官中，Mb含量的增加较为缓慢。这些观察结果表明，死后Mb的渗透程度取决于其与肌肉的距离以及接受组织的解剖学和组织学特性。
尿液中的Mb浓度似乎受早期死后变化的影响很小，这支持了其潜在的诊断价值。相反，死后血液中Mb的浓度会显著且迅速升高。使用兔子的实验表明，死亡后1小时内血液Mb水平会增加约60倍，并在24小时内继续升高至死亡前的6,600倍[8, 9]。其他研究者也在人类死后案例中报告了类似的结果，表明Mb在死亡后会迅速从骨骼肌扩散到血液中[7, 10]。此外，死后血液Mb浓度的变化还取决于采样位置，这进一步强调了阐明Mb如何进入血管系统对于法医学解释其死后水平的重要性[11]。
我们假设死后Mb会从骨骼肌穿过血管壁进入血液，并试图提供直接实验证据来证实这一点。为此，我们使用兔子的骨骼肌和猪的血管进行了模型实验，系统研究了Mb扩散的组织学和生化特性，特别关注其穿过血管壁的过程。
实验部分
实验1
将兔子的骨骼肌直接放置在猪主动脉的外膜上，然后对其进行IHC Mb染色。
试剂
用于免疫组化（IHC）染色的化学试剂和抗体如下：Tween-20（东京化学工业公司，日本东京）；单克隆小鼠抗兔Mb抗体（自主研发）作为一抗；ImPRESS? HRP通用抗体聚合物检测试剂盒（正常家兔血清和过氧化物酶聚合物马抗小鼠IgG；Vector实验室，美国加利福尼亚州）作为封闭剂
试剂
使用猪皮明胶（BioReagent，Sigma-Aldrich，美国密苏里州）制备明胶盘。用于酶联免疫吸附测定（ELISA）的化学试剂和抗体如下：单克隆小鼠抗兔Mb抗体和多克隆山羊抗兔Mb抗体（均为自主研发）分别作为固相抗体和一抗；以及单克隆小鼠抗山羊/绵羊IgG-过氧化物酶抗体（Sigma-Aldrich，美国密苏里州）作为二抗；ABTS过氧化物酶
实验1
在猪主动脉样本中外膜与兔子骨骼肌接触后15分钟，就观察到了Mb的阳性染色（图2a）。1小时后，中膜和内膜也出现了明显的阳性染色（图2）。中膜中Mb阳性区域的比率（平均值±标准误差[SE]）分别为15分钟时5.7±2.5%，1小时时5.2±0.7%，1天时5.8±1.2%（图3）。直到第
讨论
死亡后血液中的肌红蛋白（Mb）浓度会迅速升高。由于Mb主要存在于横纹肌中，这种浓度变化可能是由于Mb从肌细胞扩散到血管壁并随后渗入血液所致，尽管这一点尚未通过实验得到证实。
在法医学实践中，当对肌肉组织进行Mb免疫组化染色时，偶尔也会在邻近的血管中观察到阳性染色。
结论
本研究通过动脉的免疫组化染色和ELISA对Mb的定量分析，提供了Mb在死亡后能够穿过血管壁并进入血液的直接实验证据。
伦理声明
涉及人类的研究获得了冈山大学医学部、齿学部和药学部以及冈山大学医院伦理委员会的批准（研究编号：2202–041）。研究遵循了当地法律法规和机构要求。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）KAKENHI的资助，资助编号为JP23K21525。
