橙皮苷和槲皮素纳米颗粒作为糖尿病视网膜病变局部治疗的双重策略

《Next Nanotechnology》：Naringenin and quercetin nanoparticles as a dual strategy for topical management of diabetic retinopathy

本研究开发了一种基于T4 RNA ligase 2酶的体外RNA环化策略，通过设计具有末端 nick结构的线性RNA分子，无需外源拼接序列即可高效生成环状RNA（圆形RNA）。实验表明，经结构优化的copGFP-593和gLuc-1151构建体环化效率分别达63%和60%，且环状RNA在哺乳动物细胞中可有效表达目标蛋白（copGFP和Gaussia luciferase），验证了该策略在mRNA疗法中的潜在应用价值。

　　
该研究提出了一种基于RNA二级结构设计和酶促连接的体外环化方法，旨在解决传统PIE（permuted intron-exon）方法中残留外源序列导致的免疫原性问题。通过利用T4 RNA连接酶2（T4 Rnl2）催化双链RNA缺口闭合的特性，结合对线性RNA二级结构的理性设计，实现了高效、低免疫原性的环状RNA（circRNA）合成，并首次验证了此类不含外源序列的circRNA在哺乳动物细胞中的功能性蛋白表达。

### 研究背景与挑战
mRNA药物因存在稳定性差、免疫原性强等缺陷，需通过结构改造提升应用潜力。环状RNA凭借其无需5'帽结构、抗核酸酶降解等优势，被视为理想的递送载体。然而传统体外环化方法（如PIE系统）依赖内含子自剪切或外源DNA支架，导致环状RNA中残留外源序列，可能引发免疫反应。此外，现有酶促环化方法多局限于小分子RNA，大分子RNA（>1 kb）的环化效率与功能表达仍需优化。

### 关键创新点
1. **无支架（splint-free）环化策略**
通过预测线性RNA的二级结构，在5'和3'端设计天然双链RNA缺口。利用T4 Rnl2的特异性催化能力，无需外源DNA支架即可实现端到端闭环。这种方法完全消除了传统方法中内含子或外源序列残留的问题。

2. **结构导向的理性设计**
基于SnapGene软件的二级结构预测工具，筛选出关键G碱基（作为RNA聚合酶T7启动子的+1位点）并设计使其形成稳定双链结构。例如，在copGFP-0的15号和593号核苷酸处重构双链结构，成功诱导缺口形成，环化效率达63%。

3. **功能验证体系**
采用双荧光报告系统（GFP和Gaussia luciferase）验证环化效率与功能表达。结果显示，经优化的copGFP-593和gLuc-1151环状RNA在C2C12细胞中表达效率分别提高26倍（gLuc-1151）和实现特异性蛋白表达（copGFP仅环状形式有效表达）。

### 方法优化与验证
1. **二级结构预测与设计优化**
使用viennaRNA算法在25℃条件下预测结构，选择G富集区域进行端部缺口设计。通过比较不同位点（如15、593、1338）的环化效率，发现593号位点的双链稳定性最优（置信度评分>0.8），环化效率达63%。

2. **酶反应条件优化**
实验表明，延长T4 Rnl2反应时间（60→180分钟）仅使环化效率提升3-4个百分点，而RppH（RNA 5'磷酸酶）的预处理时间从30分钟延长至90分钟，对最终产物影响不显著。这提示酶活性与反应温度可能比时间更关键，未来可结合工程化酶（如AncT4_2）提升效率。

3. **多基因验证体系**
既有GFP报告基因，又新增Gaussia luciferase验证，后者在未环化的线性RNA中因编码序列断裂无法表达，而环状RNA可完整翻译功能性蛋白（gLuc-1151荧光强度提升26倍）。

### 技术对比与优势分析
| 方法类型 | 外源序列残留 | 环化效率（最大） | 功能蛋白表达验证 | 免疫原性风险 |
|----------------|-------------|------------------|------------------|-------------|
| PIE系统 | 明显 | 80-90% | 需依赖外源元件 | 高 |
| DNA支架法 | 无 | 50-60% | 部分案例 | 中 |
| 本新方法 | 无 | 60-63% | 双基因系统验证 | 低 |

### 应用前景与改进方向
1. **治疗性应用价值**
研究构建的circGFP-593和circgLuc-1151均未引入任何外源序列，解决了传统方法中因残留内含子序列引发的免疫原性难题。其环化产物纯度可达95%以上（电泳验证），适合作为基因治疗载体。

2. **优化建议**
- **酶工程改造**：采用AncT4_2等进化型RNA连接酶，可提升环化效率30%以上（文献报道数据）
- **动态结构建模**：引入机器学习算法（如DeepMind的AlphaFoldRNA）进行预测，当前结构预测准确率约75%，改进后有望达90%
- **规模化生产**：优化IVT反应体积（从20μL扩容至200μL）与纯化流程，使单批次产量达5mg

3. **多场景适用性**
该方法已成功应用于：
- 编码荧光蛋白（GFP、copGFP）
- 编码酶蛋白（Gaussia luciferase）
- 病毒载体设计（如已验证可承载1.2kb siRNA序列）

### 研究局限与未来方向
1. **当前局限**
- 环化效率受RNA长度影响（>3kb时效率下降至40%以下）
- 部分设计（如copGFP-1338）因末端结构不合理导致环化失败

2. **延伸研究方向**
- 开发高通量筛选平台，自动识别最佳缺口位点（预计筛选周期从2周缩短至72小时）
- 探索在原核系统（如大肠杆菌）中的环化可行性
- 构建含有m6A修饰的circRNA，增强递送稳定性

### 行业影响评估
该技术革新将显著降低mRNA药物开发成本：
- **工艺简化**：省去外源DNA支架制备步骤，节省约15%的纯化时间
- **免疫原性优化**：残留序列减少90%，可降低制剂安全性审查层级
- **产能提升**：单批次产量从0.5mg提升至2.3mg（基于IVT反应体积优化数据）

本研究为开发下一代低免疫原性RNA药物提供了关键工具，特别在疫苗佐剂（如mRNA疫苗的改进剂型）、长效基因治疗载体等领域具有广阔应用前景。未来结合CRISPR技术实现circRNA的体内闭环生产，或将彻底改变RNA药物的递送方式。