基因驱动技术在非洲本土抑制疟疾传播的重大突破：转基因按蚊成功阻断坦桑尼亚患者来源的恶性疟原虫

《Nature》：Gene-drive-capable mosquitoes suppress patient-derived malaria in Tanzania

本研究针对疟疾防控中传统方法面临的杀虫剂抗性及可持续性挑战，在坦桑尼亚建立了模块化便携式CL3级实验室(MPL/CL3)，成功构建了表达两种外源抗菌肽（magainin 2和melittin）的转基因安蚊（Anopheles gambiae）品系MM-CP。该品系通过非自主基因驱动系统，在Cas9内切酶存在下实现94.2%的遗传效率，并能显著抑制当地患儿体内分离的遗传多样性恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）孢子体发育，使唾液腺感染率降至0-7%（对照组35%），为疟疾消除提供了本土化基因技术支持。

　　

在非洲大陆，疟疾依然是威胁公共健康的重大疾病，许多国家距离实现疟疾消除目标仍很遥远。尽管室内滞留喷洒和长效杀虫剂蚊帐等传统病媒控制方法在降低疟疾发病率方面发挥了关键作用，但蚊虫对杀虫剂抗性的出现阻碍了进一步进展。非洲快速增长的人口和持续的疟疾传播风险，使得这些干预措施作为独立解决方案越来越不可持续。这凸显了对创新、自我维持且具有成本效益的新技术的迫切需求，以补充现有疟疾消除工作。基因驱动技术（gene drive）通过使特定性状发生偏性遗传，能够以超过孟德尔遗传定律预测的速率在种群中传播，为疟疾防控提供了新范式。

基因驱动技术为疟疾消除提供了变革性解决方案，可通过传播基因修饰来抑制蚊虫种群或使其无法传播疾病。本研究专注于后者，即蚊虫群体替代（population replacement）策略，通过基于CRISPR-Cas9的合成基因驱动系统，将抗寄生虫效应因子（antiparasitic effector）扩散至整个种群。与完全自主的基因驱动系统相比，本研究采用的非自主（non-autonomous）系统将效应因子和驱动功能分离，具有独特优势：允许在流行环境下独立于完整基因驱动系统开发、测试和优化效应构件；便于在引入自我传播元件前进行严格的风险评估和社区参与；为部署提供了更安全、模块化的途径。

此前，虽然已开发出有效的基因修饰，但这些努力仅限于全球北方的实验室。研究团队先前证明，改造冈比亚按蚊使其表达两种外源抗菌肽，可抑制实验室培养的恶性疟原虫NF54株的孢子生殖发育（sporogonic development），模型预测该修饰在非洲与基因驱动整合后可为疟疾消除做出重大贡献。然而，这种修饰对遗传多样性、自然传播的寄生虫分离株的有效性仍属未知。

为解决这一关键空白，研究团队通过在东非坦桑尼亚建立基础设施和研究能力，使该技术适应非洲环境，从而在封闭条件下对当地冈比亚按蚊进行基因工程改造。研究成功生成了一种具有非自主基因驱动能力的转基因品系，能强力抑制从自然感染儿童获得的遗传多样性恶性疟原虫分离株。当由另一个本地改造品系提供Cas9内切酶时，这些遗传修饰可有效遗传给后代。

为开展研究，团队专门设计了集成式模块化便携实验室和密闭等级3（MPL/CL3）昆虫饲养设施，该设施建于两个联运集装箱内，安装在坦桑尼亚Ifakara健康研究所（IHI）巴加莫约校区。该设施包含气候和照明控制系统、饲养室、微生物安全柜、水管理和废物处理系统、高压灭菌装置和装备齐全的实验室，为在非洲环境下生成、饲养和研究转基因蚊子提供了高标准安全条件。

在当地生成的第一个转基因品系zpg-CC旨在通过在同一构建体中表达Cre重组酶和Cas9内切酶来简化所有转基因过程。该双辅助品系能够有效去除两侧带有loxP位点的转基因标记，并通过归巢（homing）建立转基因纯合性。随后，研究团队成功生成了MM-CP品系，该品系包含两种抗菌肽（magainin 2和melittin），整合到内源性锌羧肽酶A1基因（CP）中。通过与zpg-CC品系杂交，并利用Cre介导的切除去除GFP标记盒，最终获得了纯合、无标记的MM-CP品系。

为评估MM-CP转基因在存在Cas9的情况下的遗传效率，研究人员进行了非自主归巢测定。将纯合MM-CP雌性与zpg-CC雄性（Cas9来源）或野生型（wt）Ifakara雄性（对照）杂交，产生的F1代子代再与野生型蚊子杂交。基因分型显示，在zpg-CC存在下，MM-CP转基因向后代的遗传率平均高达94.2±4.9%，而对照交叉显示近乎孟德尔分离（48.3±4.1%），表明当与生殖系Cas9表达结合时，MM-CP转基因具有高比率的非自主基因驱动。

生活史测定表明，与对照相比，MM-CP雌性产卵量显著减少，但孵化率相当。两性存活率均降低，其中雌性在血餐后存活率下降最为明显。尽管某些生存效应可能反映了转基因过程中的近交繁殖，并且在涉及持续异交的基因驱动条件下不太可能持续存在，但血餐后雌性存活率的急剧下降很可能由血餐诱导的CP基因座处强烈的抗菌肽表达或CP表达受干扰所驱动。这种表型被模拟为通过减少受感染雌性存活足够长时间以传播疾病的可能性来增强干预效果。尽管存在这些适应性成本，多代笼养实验表明，当与自我传播的Cas9来源结合时，MM-CP仍能被有效驱动至近固定，支持了MM-CP在基因驱动条件下的稳健性。

在巴加莫约地区三个村庄的学童中进行的寄生虫学调查显示，全年均有疟疾传播，约25-30%的筛查儿童存在寄生虫血症，2-5%存在配子体血症。对四个基因（CSP、AMA1、SERA2和TRAP）的测序证实，采样策略捕获了这些社区中具有代表性的基因型多样性。从高配子体密度儿童采集血液样本，用于蚊子直接膜饲法（DMFAs）。

研究评估了当地开发的MM-CP品系在抑制感染儿童体内传播的寄生虫方面的功效。显微镜检查显示，与野生型蚊子相比，大多数MM-CP蚊子中肠含有数量显著减少且体积明显更小的卵囊（oocyst），中位卵囊直径为22.2微米，而野生型中肠为57.3微米。分子基因分型显示，含有较大卵囊的MM-CP蚊子来自MM-CP群体中存在的杂合MM-CP或非转基因蚊子。

在第四和第五次重复感染实验中，通过qPCR（定量聚合酶链式反应）检测中肠和头/胸部组织（作为唾液腺感染的代理）中的寄生虫。在第四次重复中，42只MM-CP蚊子中有36只（85%）中肠检测到寄生虫，但无一只（0%）头/胸部寄生虫检测呈阳性。相比之下，143只野生型对照蚊子中，82只（57%）中肠阳性，50只（35%）头/胸部有寄生虫存在。在第五次重复中，104只MM-CP蚊子中56只（54%）中肠感染阳性，但仅7只（7%）唾液腺感染阳性，且感染水平均很低。

这些发现证明，早期在不同冈比亚按蚊MM-CP遗传背景感染实验室恶性疟原虫NF54株中观察到的结果——孢子体发育减少和延迟、卵囊成熟受损和唾液腺侵袭有限——在MM-CP蚊子受到来自疟疾患者的遗传多样性恶性疟原虫分离株挑战时得以重现。这突出了MM-CP表型在不同寄生虫基因型间的稳健性，并加强了其在真实世界传播环境下的潜在影响。尽管不能完全排除低水平孢子体发育最终可能导致传播的可能性，但寄生虫成熟延迟和血餐后蚊子存活率降低的结合，预计将严重限制野外条件下继续传播的可能性。

主要技术方法包括：在坦桑尼亚建立模块化CL3级实验室设施（MPL/CL3）用于转基因蚊子的培育和研究；利用CRISPR-Cas9系统构建表达Cre重组酶和Cas9内切酶的双辅助转基因蚊子品系（zpg-CC）及表达抗菌肽的MM-CP品系；通过直接膜饲法（DMFA）使用坦桑尼亚当地患儿来源的恶性疟原虫配子体感染蚊子；采用显微镜观察、卵囊测量和qPCR技术分析寄生虫感染强度、卵囊发育和孢子体负载；通过系统发育分析评估当地寄生虫基因多样性。

传播效率和生命史特征

通过非自主归巢测定评估MM-CP转基因的传播效率，证实当与zpg-CC品系（提供Cas9）结合时，MM-CP转基因呈现高达94.2%的高遗传率。生活史特征分析显示MM-CP雌蚊产卵量显著降低，血餐后存活率明显下降，这些特征有助于降低疾病传播概率。

对现场分离恶性疟原虫的抑制效果

使用患者来源的配子体进行感染实验，发现MM-CP转基因蚊子可显著抑制卵囊生长，卵囊直径中位数仅为野生型蚊子的40%。通过qPCR检测发现，MM-CP蚊子唾液腺孢子体感染率极低（0-7%），而野生型蚊子感染率达35%，表明该转基因可有效阻断孢子体向唾液腺的迁移。

转基因品系的构建与表征

成功在本地构建了zpg-CC辅助品系和MM-CP效应品系，建立了高效的转基因纯合化和标记剔除技术平台。证实zpg-CC品系可高效介导Cre重组酶介导的标记剔除和Cas9介导的归巢作用，为基因驱动技术的应用奠定了基础。

本研究标志着基因驱动技术在非洲迈向试验和应用的新阶段，在坦桑尼亚成功生成能抑制当地传播的恶性疟原虫的转基因冈比亚按蚊。该工程菌株通过抑制恶性疟原虫卵囊生长，导致孢子体向蚊子唾液腺迁移延迟，为阻断疟疾传播创造了屏障。其对现场来源寄生虫的有效性确保研究结果可直接应用于真实传播环境，为野外试验奠定了坚实基础。研究在坦桑尼亚专门建造的高生物安全设施内执行，强调了非洲主导的研究基础设施和专业知识的的重要性。除了推动当前研究，这些设施现已成为区域利益相关方参与、培训和未来技术评估的可扩展、可持续平台。该研究展示了基因驱动技术在疟疾消除方面的潜力，以及持续投资本地能力建设以确保其安全、有效和公平实施的关键需求。