《Talanta》：An ESIPT-based fluorescent probe for visualizing pH dynamics during oxidative stress in living system
编辑推荐：
本论文设计并合成了一种基于ESIPT效应的苯并噻唑类荧光探针LYB-OH，用于监测氧化应激导致的细胞内pH动态变化。该探针在水中的斯托克斯位移达220 nm，具有高选择性和稳定性，可有效观测H2O2和LPS诱导的细胞及斑马鱼pH波动，为相关疾病诊断提供新工具。
强飞|杨佳怡|罗彦碧|李志瑶|袁旭|刘汉飞|兰俊杰|王飞仪|李金玉|潘卫东
中国贵州省贵阳市贵州医科大学传统中药功能成分发现与利用国家重点实验室，贵州省天然产物研究中心，邮编550014
摘要
细胞氧化应激表现为活性氧（ROS）的过度产生，会破坏细胞内稳态并导致细胞和细胞器内的pH值波动。鉴于细胞内pH值在维持内稳态和调节增殖、酶活性等关键过程中的重要作用，我们设计并合成了基于苯并噻唑的荧光探针LYB-OH用于pH值监测。LYB-OH在各种溶剂中均表现出显著的大斯托克斯位移，尤其是在水中，其斯托克斯位移超过了200纳米。此外，LYB-OH在体外具有良好的选择性、稳定性和可逆性。在生物成像中，该探针表现出低细胞毒性和对不同pH值的良好成像能力。进一步地，该探针能够可视化由过氧化氢和脂多糖诱导的细胞和斑马鱼体内的pH值变化，为诊断氧化应激下由细胞内pH值波动引起的相关疾病提供了依据。
引言
氧化应激会导致生物体内的氧化还原失衡，产生过多的活性氧（ROS），引起细胞毒性和组织损伤[[1], [2], [3], [4], [5], [6]]，并引发多种疾病，如癫痫和缺血[[7], [8], [9], [10]]。在氧化应激过程中，线粒体功能障碍会破坏质子梯度的内稳态，导致细胞质酸化，进而通过酸激活的蛋白酶加剧细胞损伤[[11], [12], [13], [14]]。这种ROS与pH值的相互作用在疾病进展中形成了一个恶性循环，然而在体内实时监测它们的时空关系在技术上仍然具有挑战性。与传统方法相比，许多研究人员更倾向于使用荧光探针，因为它们具有高灵敏度、快速反应、操作简便和良好的生物相容性[[15], [16], [17], [18]]。激发态分子内质子转移（ESIPT）荧光团在pH值传感方面具有独特优势：大的斯托克斯位移可以消除自吸收，快速的互变异构过程提高了光稳定性，优异的穿透能力增强了生物样本检测的灵敏度[[19], [20], [21]]。尽管已经开发了许多pH值荧光探针[[22], [23], [24], [25], [26]]，但用于监测细胞内pH值波动的探针相对较少，尤其是基于ESIPT效应的探针。我们假设pH响应型ESIPT支架可以创建一个统一的平台来可视化氧化应激引起的酸化现象。
因此，我们开发了一种新型的基于ESIPT的荧光探针LYB-OH，它含有一个双苯并噻唑结构，用于可视化生物体内氧化应激下的pH值波动。LYB-OH是通过2-(2′-羟基苯基)苯并噻唑（HBT）和2-(苯并[d]噻唑-2-基)丙腈（BTAN）之间的Knoevenagel缩合反应制备的。在LYB-OH中，HBT作为电子供体，BTAN作为电子受体。LYB-OH在水中表现出良好的稳定性和大的斯托克斯位移（>200纳米），这在已报道的基于ESIPT的pH-氧化应激探针中较为突出[[27]]。同时，该探针对pH值变化具有良好的选择性和可逆性。在活细胞和斑马鱼中的生物成像实验进一步证明LYB-OH能够有效监测细胞内氧化应激期间的pH值波动。这种探针为监测活体系统中由氧化应激引起的pH值波动提供了一种潜在的工具。
试剂与合成
除非另有说明，所有试剂均来自商业供应商。LYB-OH的制备遵循图1所示的合成路线。化合物1和2的合成方法参考了相关文献[28,29]。相关化合物的特征光谱附在补充材料中（图S1–S9）
LYB-OH的光物理特性
我们首先评估了LYB-OH在各种溶剂中的光学性质。如图2和表S1所示，LYB-OH的最大吸收峰位于370–510纳米范围内，发射峰位于454–600纳米范围内。该探针表现出显著的ESIPT效应，斯托克斯位移范围为162–220纳米。令人兴奋的是，LYB-OH在水中的斯托克斯位移达到了220纳米，这优于其他基于ESIPT的探针分子。
结论
总之，我们成功构建了一种新型的基于ESIPT的双苯并噻唑荧光探针LYB-OH，用于监测pH值波动。LYB-OH具有典型的供体-受体结构，在水中表现出大的斯托克斯位移（>200纳米）。它对pH值具有优异的灵敏度和选择性，能够精确检测细胞内pH值的动态变化。此外，通过模拟细胞内氧化应激，LYB-OH建立了细胞内pH值波动与氧化应激水平之间的关联。
CRediT作者贡献声明
强飞：撰写初稿、方法学设计、资金申请。杨佳怡：方法学设计、实验研究、数据管理。罗彦碧：方法学设计、实验研究、数据管理。李志瑶：方法学设计。袁旭：方法学设计、数据管理。刘汉飞：方法学设计、数据管理。兰俊杰：数据管理。王飞仪：方法学设计、实验研究、数据管理。李金玉：撰写、审稿与编辑、指导、概念构思。潘卫东：撰写、审稿与编辑、指导
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号81960635、82473815）、贵州省科技项目（编号QKHPTRC-CXTD [2022] 002）、贵州省教育厅-自然科学研究项目（编号QJJ [2023] 042）以及贵州省大学生创新项目（编号S2024109760187）的资助。
