新型半胱天冬酶抑制剂F573的全面临床前药代动力学和代谢物分析

《Talanta》：Comprehensive Preclinical Pharmacokinetics and Metabolite Profiling of a Novel Caspase Inhibitor F573

高效液相色谱-串联质谱法在新型凋亡抑制剂F573药代动力学研究中的应用，解决了高血浆蛋白结合和复杂生物样本基质干扰问题，首次全面表征了F573在小鼠和犬类中的吸收、分布、代谢和排泄特征，发现约56%原药经尿液和胆汁排泄，并鉴定出8种代谢产物。

　　

顾一平|叶晓敏|周顺昌|曾凡典|吴珊|王琼琼|苗雪燕|罗颖|吴建红

中国武汉药物与医疗器械控制研究所，430075

摘要

对于新型半胱天冬酶抑制剂F573在急性肝衰竭方面的临床前开发而言，一种稳健且多用途的生物分析方法至关重要。这一研究面临诸多挑战，包括需要高灵敏度来监测其快速的全身清除过程、处理多样且复杂的生物样本（如血浆、组织和排泄物），以及克服高血浆蛋白结合率（>89%）带来的干扰。为应对这些挑战，我们开发并验证了一种灵敏、选择性强的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于在这些样本中定量F573，并具备代谢物定性分析的能力。该方法采用了一种优化的简单蛋白质沉淀协议，适用于高通量处理。该方法严格遵循FDA指南进行了验证，显示出低定量限（LLOQ为2 ng/mL，在50 μL血浆中），出色的精确度（RSD <15%）和准确性。该方法有效解决了高血浆蛋白结合和样本复杂性带来的问题。通过该方法，我们首次全面了解了F573的临床前特性：该药物在大鼠和狗体内吸收迅速且清除快，组织分布广泛，但血脑屏障穿透能力有限。大约56%的给药剂量以原形通过尿液和胆汁途径排出体外。此外，在大鼠样本中鉴定并分析了8种不同的代谢物。因此，所开发的LC-MS/MS方法成为F573全面临床前药代动力学评估的关键可靠工具，凸显了其在支持这一有前景的治疗候选药物开发中的价值。

引言

凋亡是一种受基因调控的程序性细胞死亡形式，对于维持组织稳态和清除受损细胞至关重要[1]。其失调与多种病理状态有关，包括急性肝衰竭（ALF）[2]、[3]、缺血性损伤[4]、神经退行性疾病[5]和癌症[6]、[7]。作为凋亡的主要执行者，半胱天冬酶已成为重要的治疗靶点[8]、[9]、[10]。

F573（zVD-FMK）[11]、[12]、[13]是一种泛半胱天冬酶抑制剂，具有二肽骨架和氟甲基酮活性基团，在包括急性肝衰竭和脑缺血在内的多种疾病模型中表现出显著的细胞保护作用[11]。与Z-VAD-FMK等传统抑制剂相比，F573具有更好的水溶性，提高了其药物开发和治疗潜力，使其成为一种有前景的候选药物[11]。为了全面评估F573的药物开发潜力并推动其临床转化，系统的临床前药代动力学（PK）和生物分布研究是不可或缺的[14]、[15]。

然而，以往这些研究受到缺乏稳健生物分析方法的限制——该方法需要具备足够的灵敏度、特异性和样本处理能力，以准确量化F573及其代谢过程。主要的方法学挑战包括：1）实现足够的灵敏度以捕捉其预期的快速清除动力学；2）减轻高血浆蛋白结合对定量结果的影响；3）为血浆、组织匀浆液和排泄物等不同样本制定统一的处理策略；4）确保区分母药与其潜在代谢物的能力。

为填补这一方法学空白，我们根据相关监管指南[16]、[17]开发并全面验证了一种选择性高、灵敏度强的LC-MS/MS方法。主要目标是建立一种可靠且经过验证的方法，用于系统评估F573在啮齿类和非啮齿类动物模型中的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特性[18]、[19]、[20]。该方法的成功应用有助于阐明F573的绝对生物利用度、组织分布、排泄途径和代谢途径，为其作为有前景的治疗药物的发展提供了关键的分析基础。

方法开发与优化

通过直接注入F573标准溶液和几种候选内标（IS）溶液，优化了质谱条件。F573含有羧酸基团和氟甲基酮结构，在负ESI模式下由于有效的去质子化作用而显示出较强的信号强度，形成稳定的[M?H]?离子。选择贝扎贝特（Bezafibrate）作为内标，因为它具有类似的化学特性（羧酸基团和酰胺基团），确保了相似的提取效率。

结论

本研究成功开发了一种简单、灵敏且经过全面验证的LC-MS/MS方法，用于F573的绝对定量，并对其代谢物进行了全面的结构表征。该方法有效克服了高血浆蛋白结合和多种生物样本复杂性带来的挑战，证明了其稳健性和多用途性，符合监管标准。

作者贡献声明

顾一平：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、实验设计、资金获取、数据管理。吴建红：撰写——审稿与编辑、项目监督、方法学设计、资金获取、概念构思。罗颖：资源协调、项目监督、资金获取。王琼琼：实验设计。苗雪燕：数据可视化。曾凡典：项目监督、方法学设计。吴珊：实验设计、数据管理。叶晓敏：撰写——审稿

资金信息

本研究得到了广西壮族自治区自然科学基金（项目编号：2023GXNSFAA026416）和上海基因组公司（中国上海）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能的利益冲突/个人关系：吴建红表示获得了上海基因组公司（中国上海）的财务支持。其他作者声明他们没有已知的可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。