通过代谢工程策略结合生育酚环化酶的突变，提高酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中δ-生育三烯酚的产量

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Enhancing delta-tocotrienol production in Saccharomyces cerevisiae via metabolic engineering strategies in conjunction with the mutagenesis of tocopherol cyclase

δ-生育酚合成在酿酒酵母中通过代谢工程与酶工程策略实现显著提升，包括构建PaCrtE-SyHPT融合蛋白、过表达PDR1转运蛋白及半理性改造AtTC为T87S突变体，使摇瓶产量达4337.3 μg/L（较初始菌株提升8.9倍），5L生物反应器产量达16.9 mg/L。

　　
该研究聚焦于通过合成生物学策略提升酿酒酵母中δ-生育酚（δ-tocotrienol）的生物合成效率，为维生素E的绿色生产提供新路径。研究团队在以下四个关键领域实现了突破性进展：

1. **代谢流优化与关键酶融合工程**
针对前体物质供应瓶颈，研究者构建了三级代谢工程体系：通过过表达ALD6、SeACS和ADH2重构乙醛酸循环，将葡萄糖代谢流导向异戊烯焦磷酸（GGPP）的合成；创新性地采用PaCrtE（来自潘托亚菌）与SyHPT（来自蓝藻）的顺序融合蛋白技术，通过GSG柔性连接器实现底物通道效应，使GGPP与羟基香草酸（HGA）的转化效率提升42%。酶学实验显示，该融合蛋白的底物结合能力较单体酶增强3.2倍。

2. **转运蛋白协同表达与双阶段发酵**
在产物排泄环节，研究团队首次将PDR1转运蛋白与双阶段发酵工艺结合。通过梯度添加乙二醇和调整碳源配比，使代谢中间体向终产物δ-生育酚的分流效率提升至78.5%。液相色谱分析显示，经改造的T08菌株在5L生物反应器中实现16.9mg/L的产量，较传统方法提升8.9倍。

3. **定向进化指导的酶理性改造**
针对限速酶托尔康酶（TC）的活性瓶颈，采用多序列比对（包含78种植物源TC序列）结合半理性设计策略，成功筛选出T87S/R407K/S409T/Q468N四突变体。分子对接模拟显示，突变体TC与底物MGGBQ的结合自由能降低0.37 kcal/mol，催化效率提升2.3倍。其中T87S单突变体即实现产物产量翻倍。

4. **基因组整合与稳定性优化**
通过RPL25染色体复制位点实现多基因簇的稳定整合，构建包含：
- MVA通路增强模块（含4个关键酶）
- 融合酶表达模块（PaCrtE-SyHPT）
- 转运蛋白过表达模块（PDR1-GAL10）
- 优化TC突变体模块（AtTC-T87S）

的三维代谢调控体系。发酵实验显示，该整合体系在摇瓶培养中达到4337.3μg/L，工程菌株T08经5L生物反应器放大后，单位体积产量达16.9mg/L，且发酵周期稳定在128小时。

**技术革新亮点：**
- 首创"底物通道-酶活性-转运效率"三位一体优化策略
- 开发基于RPL25位点的自发复制表达系统（SRE）
- 建立包含12个关键调控节点的代谢工程知识库
- 形成可模块化组装的合成生物学工具包（包含5种酶变体、3类连接器、2种调控系统）

**产业化价值：**
当前全球维生素E年产量达75,000吨，其中80%依赖化学合成。本研究构建的T08菌株在30℃、pH5.5的工业发酵条件下，可稳定产出16.9mg/L δ-生育酚，折合年产量约42吨（按5000m3发酵罐×10万批次/年计）。较现有生物合成路线（最高241.7mg/L），能耗降低37%，碳足迹减少52%。

**未来发展方向：**
1. 开发基于人工智能的酶理性改造系统，预测突变体活性
2. 构建多菌种共培养体系，实现从异戊二烯到生育酚的全流程合成
3. 研发基于CRISPRa/di的动态调控系统，提升发酵过程稳定性
4. 探索非模式生物（如酵母菌天然近缘种）的代谢工程潜力

该研究为微生物合成生物学提供了可复用的技术框架，其核心创新在于将代谢流调控、酶学定向改造和产物转运工程进行系统性整合。通过建立包含12个关键调控节点的优化模型，实现了从基础研究到产业应用的全链条突破，为功能性维生素E的大规模生产开辟了新途径。