奈洛尔公牛急性阴囊隔热现象会损害附睾精子的氧化磷酸化过程及雌激素信号传导机制

《Theriogenology》：Acute scrotal insulation in Nelore bulls impairs oxidative phosphorylation and estrogen signaling in epididymal sperm

本研究评估急性附睾热应激（HS）对牛精子及精液血浆蛋白组的影响。14头18月龄 Nelore 公牛分为三组（12H、24H、48H阴囊绝缘），发现HS导致精子线粒体电子传递抑制及糖代谢相关蛋白上调，同时能量代谢、氧化应激、免疫及细胞骨架相关蛋白下调，但精子活力和形态未显著改变。

　　

亨利·D·莫戈隆-加西亚（Henry D. Mogollón-García）、安东尼奥·G·R·普普利姆（Ant?nio G.R. Pupulim）、加布里埃拉·C·里贝罗（Gabriella C. Ribeiro）、保拉·Z·拉特（Paula Z. Rate）、吉列尔梅·里佐托（Guilherme Rizzoto）、约翰·P·卡斯特利克（John P. Kastelic）、拉马纳坦·卡西马尼卡姆（Ramanathan Kasimanickam）、法比安娜·F·索扎（Fabiana F. Souza）、若昂·C·P·费雷拉（Jo?o C.P. Ferreira） 巴西圣保罗州立大学（Universidade Estadual de S?o Paulo，简称Unesp）兽医医学院和动物科学学院兽医外科与动物繁殖系，博图卡图（Botucatu）

摘要

本研究旨在评估急性附睾热应激（epididymal heat stress，HS）对牛精子及精浆蛋白质组的影响。选取14头约18个月大的尼洛尔牛（Nelore bulls），其精子活动率为70%以上，形态正常精子占比也达到70%以上，将其分为三组：12H组（n=5，阴囊隔离12小时）、24H组（n=5，阴囊隔离24小时）和48H组（n=4，阴囊隔离48小时）。在阴囊隔离前后分别采集精液样本，并检测精浆和精子中的差异表达蛋白（differentially abundant proteins，DAPs）。结果显示，48H组的内睾丸温度最高（平均值±标准误分别为38.6±0.5°C、37.3±0.3°C、35.6±0.7°C和35.2±0.2°C，P<0.05）。各组之间的精子活动率和形态无明显差异。阴囊隔离处理后，精浆和精子中分别检测到172种和518种差异表达蛋白。急性附睾热应激导致精浆和精子蛋白质组发生显著变化：在精浆中，下调的蛋白质主要与ATP生成、抗氧化应激防御、免疫功能及精子细胞骨架完整性相关；在精子中，蛋白质变化与线粒体电子传递（氧化磷酸化）抑制及雌激素信号通路相关，同时糖酵解/糖异生相关蛋白表达增加。尽管如此，精子活动率未受影响。

引言

热应激（HS）会负面影响动物的生产力和繁殖能力[1][2]。在以牧场为基础的动物生产系统中，温度波动的影响尤为显著，高温会损害多种生理和繁殖功能[3][4]。 在公牛中，精子质量存在季节性变化，夏季热应激的负面影响更为明显。例如，冬季和春季的精子总活动率和 progressive motility（指精子运动能力的持续状态）通常高于夏季[5]。此外，热应激还会降低精子其他质量指标，如顶体反应能力及线粒体膜电位[6]。 蛋白质组学分析发现不同品种间的精液蛋白存在差异，某些蛋白质与热带气候下的生育能力提升有关[7][8]。环境热应激也会影响精液蛋白质组，例如高温会降低与能量代谢和氧化应激相关的蛋白质表达[9]。相反，冬季时精子活动率提高，簇蛋白（clusterin）和白蛋白（albumin）等蛋白质水平上升，表明精子功能改善[10]。热应激还会影响异常精子的蛋白质组。在经历阴囊隔离处理的荷斯坦公牛中，研究发现畸形精子（pyriform sperm）中与精子 capacitation（精子成熟过程）、精子-卵子相互作用及精子细胞骨架相关的蛋白质下调，而抗氧化活性、细胞凋亡及代谢过程相关蛋白质上调[11]。不同品种对热应激的敏感性也不同，印度牛（Bos indicus）比欧洲牛（Bos taurus）更具耐受性，前者在温暖月份通常具有更好的精子活动率、更少的形态异常精子以及较低的精液氧化应激标志物[12][13][14]；而欧洲牛在夏季的形态异常精子数量更多[15]。 通过阴囊隔离等实验模型，研究人员揭示了热应激对精子质量变化的分子机制。在欧洲牛和印度牛中，阴囊隔离处理降低了参与精子功能和生育能力的蛋白质表达[16][17]，但印度牛对热应激的耐受性和适应能力更强，表现为血清皮质醇浓度较低、形态异常精子比例较低，且热应激后的精液参数更优[18]。 安格斯牛（Angus bulls，属于欧洲牛品种）在阴囊隔离后1周内出现近端胞质滴状结构（proximal cytoplasmic droplets）和精子中部结构缺陷。全身加热（28°C，湿度30-34%）处理8天的公羊也表现出精子缺陷增加[19]。因此，热应激同样会影响附睾中的精子。了解急性热应激对精子及精浆蛋白质组的影响对于减轻其不良后果至关重要。

结果

研究通过分析精液和评估阴囊状况来评估热应激的急性影响。各组之间的射精量、精子活动率、精子浓度及阴囊周长无显著差异（P > 0.05）。然而，48小时阴囊隔离组的睾丸内温度（38.6 ± 0.5°C）高于12小时隔离组和对照组（35.6 ± 0.7°C和35.2 ± 0.2°C，P < 0.01，见图1A）。 平均环境温度为22.3 ± 0.4°C。

讨论

应激是一种导致机体失衡的状态，会破坏体内平衡并引发神经、神经内分泌和免疫系统的非特异性反应[29]。通过适应应激并实现稳态的变应态（allostasis）机制是维持体内平衡的有效方式，这一过程需要消耗能量[30]。 热应激是畜牧业中最常研究的应激类型[31][32]。

结论

热应激在开始后48小时内导致精浆和精子蛋白质组发生显著变化，主要表现为参与ATP生成、抗氧化应激防御、先天免疫功能及精子细胞骨架完整性的蛋白质下调，表明附睾和储存的精子对热损伤较为敏感。精子蛋白质组的变化主要与线粒体电子传递机制的抑制有关。 作者声明不存在可能影响研究公正性的利益冲突。 安东尼奥·G·R·普普利姆（Ant?nio G. R. Pupulim）： 负责初稿撰写、实验设计和概念构思。 加布里埃拉·C·里贝罗（Gabriella C. Ribeiro）： 负责初稿撰写和实验设计。 亨利·D·莫戈隆-加西亚（Henry D. Mogollón García）： 负责初稿撰写、实验设计和数据分析。 法比安娜·F·索扎（Fabiana F. Souza）： 负责审稿和编辑工作、实验设计及概念构思。 若昂·卡洛斯·皮涅罗·费雷拉（Jo?o Carlos Pinheiro Ferreira）： 负责审稿和编辑工作、项目监督及资金申请。 约翰·P·卡斯特利克（John P. Kastelic）： 负责审稿和编辑工作。 本研究的数据（包括补充表1）可在Mendeley数据仓库获取：https://data.mendeley.com/preview/x7nwggnzkm?a=2c4ecdaf-7d52-44b2-92b1-a991d718db10 本研究由巴西圣保罗研究基金会（FAPESP，项目编号2020/15556-8）、巴西联邦研究生教育支持与评估机构（CAPES，拨款编号001）以及CAPES PRINT-Unesp资助。 作者声明不存在可能影响本研究结果的财务利益冲突或个人关系。 感谢巴西能源与材料研究中心（CNPEM）在蛋白质组样本处理方面的支持。