通过使用GPTδ大鼠进行的全面毒性研究，对2-异丙基-N-2,3-三甲基丁酰胺进行了评估

《Toxicology and Applied Pharmacology》：Evaluation of 2-isopropyl- N-2,3-trimethylbutyramide by a comprehensive toxicity study using gpt delta rats

ITB对F344 gpt delta大鼠的13周口服毒性研究表明，≥50 mg/kg/day剂量引发神经症状及肝细胞空泡化，≥5 mg/kg/day导致肾重增加和血清氯水平下降，提示肾毒性；未发现基因突变或肝致癌性。研究为ITB安全性评估提供关键数据。

　　

光本龙也（Tatsuya Mitsumoto）| 石井雄二（Yuji Ishii）| 高本纪文（Norifumi Takimoto）| 高杉真二（Shinji Takasu）| 泉木萌香（Moeka Namiki）| 豊田武（Takeshi Toyoda）| 小川久美子（Kumiko Ogawa）

日本神奈川县川崎市川崎区东町3-25-26，国立健康科学研究所病理学部门，邮编210-9501

摘要

2-异丙基-N-2,3-三甲基丁酰胺（ITB）是一种被归类为脂肪族酰胺的食品调味剂。2016年，联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会对ITB进行了评估，认为需要进一步的数据来评估其毒性和体内遗传毒性。在本研究中，我们利用报告基因转基因动物全面研究了ITB的毒性。F344 gpt delta雄性大鼠通过口服灌胃给予ITB，剂量分别为0、50或500毫克/千克/天，持续13周。在剂量≥50毫克/千克的情况下，治疗早期出现了神经系统症状。在剂量≥50毫克/千克时，组织病理学检查发现肝细胞周围出现空泡化现象，同时肝脏重量增加和血清丙氨酸氨基转移酶水平升高。剂量≥5毫克/千克时，肾脏重量增加和血清氯化物水平下降，表明ITB在较低剂量下也具有潜在的肾毒性。因此，本研究中观察到的最低不良效应水平为5毫克/千克/天。在肝脏或肾脏中未检测到gpt和red/gam突变频率的显著变化，说明ITB没有遗传毒性。GST-P阳性灶的免疫组化分析也表明ITB没有致癌潜力。总体而言，我们的研究结果表明ITB会引起肝肾毒性，但没有体内遗传毒性或致癌潜力的证据，为安全性评估提供了重要信息。

引言

2-异丙基-N-2,3-三甲基丁酰胺（ITB；CAS 51115–67-4）在室温下为白色固体，具有轻微的薄荷醇样清凉气味。ITB被用作食品调味剂，属于脂肪族酰胺，被美国风味和提取物制造商协会（FEMA）认定为“普遍认为安全（GRAS）”物质。FEMA根据其GRAS认定确定的最大使用量如下：酒精饮料8.0 ppm，糖果糖霜150 ppm，硬糖50 ppm，口香糖3000 ppm（Smith等人，1996年）。根据国际风味产业组织的数据，2013年欧洲的ITB年产量为4公斤，美国为83,100公斤（联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会，2016年）。

在联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会第65次会议上，估计美国人均ITB暴露量为1054微克/人/天，超过了III类物质的人体暴露阈值（90微克/人/天）。III类物质包括那些结构特征不足以初步判断安全性的调味剂，甚至可能具有显著毒性（联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会，2005年）。在第82次会议上，一项为期14天和两项为期14周的大鼠口服重复剂量研究显示，剂量超过10毫克/千克时会出现肝肾毒性。相比之下，之前的一项为期90天的膳食研究仅显示肝毒性，未观察到不良效应水平（NOAEL）为25毫克/千克。因此，委员会指出了肾效应的不一致性，并对如何处理这些效应和确定NOAEL表示担忧。在遗传毒性评估方面，ITB在沙门氏菌反向突变试验中未显示诱变活性。ITB在雌性大鼠肾脏的染色体畸变试验和彗星试验中也未显示出阳性结果。然而，在雄性大鼠肾脏的彗星试验中获得了弱阳性结果。因此，委员会呼吁进行更多的体内遗传毒性研究。

gpt delta转基因啮齿动物被开发用于检测各种组织中的基因突变。由于gpt delta动物与其对应的对照组动物在毒理学反应和自发性致癌性方面没有差异，因此使用gpt delta动物进行的13周重复剂量测试可以评估目标器官的遗传毒性和一般毒性。此外，通过分析GST-P阳性的肝前病变灶可以预测大鼠肝脏的致癌潜力。事实上，我们利用gpt delta大鼠和小鼠进行的为期13周的全面毒性研究成功评估了多种调味剂的毒性、遗传毒性和致癌性，如呋喃衍生物和烯基苯（Jin等人，2011年；Takasu等人，2023年；Kuroda等人，2022年；Ishii等人，2023年）。先前的研究对ITB的肾毒性结果不一，虽然怀疑其可能存在肾遗传毒性，但未对其体内诱变性进行检测。因此，使用gpt delta大鼠进行全面的毒性分析是提供支持ITB风险评估生物学数据的有效工具。

本研究旨在通过评估大鼠体内ITB的毒性和遗传毒性潜力来澄清这些不确定性。F344 gpt delta大鼠通过口服灌胃给予ITB，剂量分别为5、50和500毫克/千克/天，持续13周，并使用gpt检测和Spi^-检测进行一般毒性和遗传毒性评估，以及通过定量分析GST-P阳性灶进行致癌性评估。

材料与方法

本研究遵循了NIH（国家研究委员会）关于实验室动物护理和使用的指南，并按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行了报告。

临床观察、体重和食物摄入量

在500毫克/千克组中，有一只大鼠在给药第3天死亡。临床观察结果总结在表1中。给药后5至30分钟内，500毫克/千克组的所有动物都出现了过度活跃、梳理毛发增多、震颤和步态不稳等神经系统症状。给药后30分钟，大多数动物的眼睛出现红色分泌物，一只动物在给药后4小时出现深呼吸。在该剂量下，所有动物都表现出活动减少的情况。

讨论

在我们使用gpt delta大鼠进行的全面毒性研究中，高剂量组有一只大鼠在给药第三天死亡。在该组中，给药早期观察到了活动减少、鼻周区域污渍以及侧卧姿势，这些现象表明身体状况恶化并伴随食物摄入量减少。这些结果表明高剂量的ITB暴露可能是致命的。尽管给予剂量超过50毫克/千克的动物...

作者贡献声明

光本龙也（Tatsuya Mitsumoto）：撰写——初稿、研究、数据分析、概念构思。石井雄二（Yuji Ishii）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、研究、资金获取、数据分析、概念构思。高本纪文（Norifumi Takimoto）：撰写——审稿与编辑、研究。高杉真二（Shinji Takasu）：撰写——审稿与编辑、研究。泉木萌香（Moeka Namiki）：研究。丰田武（Takeshi Toyoda）：撰写——审稿与编辑、研究。小川久美子（Kumiko Ogawa）：撰写——审稿与编辑、监督。

利益冲突声明

作者声明与本研究无利益冲突。光本龙也是位于日本静冈的Bozo Research Center公司的员工。高本纪文是位于日本大阪的Ono Pharmaceutical公司的员工。

致谢

我们感谢Saikawa Ayako女士和Komatsu Yoshimi女士在组织学材料处理方面提供的技术协助。本研究得到了日本卫生劳动福利部（Grant-in-Aid for Sciences Research，编号21KA1001）和日本消费者事务局（Grant-in-Aid，编号24KA1008）的支持。