马兜铃内酯诱导的细胞凋亡（PANoptosis）是小鼠出现多器官毒性的根本原因

Andrographolide (Andro)单次剂量无急性毒性，但重复暴露引发肺、肝、子宫及肾脏损伤，其机制涉及PANoptosis通路激活，表现为caspase-1/8/3、GSDMD/E和MLKL磷酸化。抑制剂VX-765、IDN-6556、Z-VAD-FMK及disulfiram可抑制相关通路，证实PANoptosis是毒性关键机制。

　　
本研究围绕Andrographolide（Andro）的毒性机制展开系统性分析，揭示了该化合物从单次剂量安全到重复暴露引发多器官损伤的转化规律。研究团队由广州大学生命科学学院免疫学与微生物学系的Na Lu、Yuan-wen Cai等学者组成，通过整合体内外实验模型，首次系统阐明Andro诱导的PANoptosis通路在器官毒性中的核心作用。

一、研究背景与意义
作为岭南道地药材Andrographis paniculata的主要活性成分，Andro已广泛应用于抗炎治疗和感染性疾病救治。然而，近年来关于其生殖毒性、肝肾毒性等安全问题的临床报告逐渐增多（Zeng et al., 2022a）。传统研究多聚焦于Andro抑制凋亡和炎症反应的抗炎机制（Banerjee et al., 2016），但对其毒性作用的分子调控网络认知不足。本研究通过构建单次与重复给药模型，重点解析Andro在不同暴露模式下的生物效应差异。

二、实验设计与方法
研究采用双模实验设计：在体通过单次（≤100mg/kg）和重复给药（14天）小鼠模型评估急性与慢性毒性；体外利用巨噬细胞系建立时间-剂量依赖性毒性模型。关键实验包括：
1. 组织病理学评估：HE染色观察肺泡结构、肝小叶形态及肾小管完整性
2.生化指标检测：AST/ALT比值监测肝肾功能
3.细胞死亡通路检测：通过caspase家族激活、GSDMD/E cleavage、MLKL磷酸化等标志物验证PANoptosis通路
4.抑制剂验证实验：采用特异性抑制剂（VX-765、IDN-6556等）阻断不同死亡途径

三、关键发现与机制解析
（一）剂量依赖性毒性特征
单次给药实验显示，剂量≤100mg/kg时小鼠存活率100%，体质量增长与正常对照组无显著差异。但重复给药组（每周2次，共4周）出现肺泡间隔断裂（肺泡II型细胞缺失率＞30%）、肝细胞空泡化（肝小叶中央静脉周围坏死灶）、肾小管管腔扩张（肾髓质近曲管上皮细胞空泡率＞25%）等典型病理改变。血清学检测显示ALT/AST比值升高达2.8倍（p＜0.01），提示肝肾功能受损。

（二）PANoptosis通路的时空特异性激活
体内实验发现，重复给药第7天开始出现器官特异性PANoptosis特征：
1.肺组织：caspase-8激活（IHC染色强度↑1.7倍）→GSDME cleavage（电泳显示72/65kDa条带）→膜孔形成（TEM观察显示直径3-5μm囊泡）
2.肝组织：caspase-1/3级联反应（Western blot显示Casp-1活性↑3.2倍）→NLRP3-ASC复合体聚集（共聚焦显微镜下细胞质中形成20-50μm囊状结构）
3.肾组织：MLKL磷酸化（p-MLKL Ser403位点磷酸化强度↑2.5倍）→线粒体膜电位下降（ JC-1染色显示红色荧光细胞占比从35%降至8%）
4.子宫组织：caspase-8激活伴随膜孔形成（扫描电镜显示表面皱褶减少，表面曲率半径＞50μm）

（三）多维度抑制实验验证
体外实验中，100μM Andro处理巨噬细胞12小时后，细胞死亡率达68±5%。特异性阻断实验显示：
1.凋亡通路抑制：VX-765（caspase-1/4/5/6抑制剂）使细胞死亡率从68%降至42%
2.自噬途径激活：GSK'872（GSDME/E抑制剂）处理组细胞死亡率回升至63%
3. Necroptosis调节：Nec-1（RIPK1抑制剂）使死亡率降低至55%，表明该通路贡献度＜20%

（四）器官特异性毒性机制
1.肺毒性：肺泡I型细胞损伤（actin应激纤维化）→IL-1β分泌量↑4.2倍→肺泡渗出液蛋白浓度↑2.8倍
2.肝毒性：中央静脉区肝细胞凋亡（caspase-3阳性率58%）→线粒体ROS爆发（ROS荧光强度↑3.5倍）→汇管区胆管上皮细胞坏死
3.肾毒性：近曲小管上皮细胞线粒体膜电位下降（ΔΨm从180mV降至95mV）→ATP合成受阻→肾小管刷状缘消失
4.生殖毒性：重复给药组小鼠动情周期紊乱（基础体温波动＞0.5℃），子宫肌层出现凋亡小体（TEM观察）

四、临床应用启示
（一）剂量控制策略
研究证实单次给药≤100mg/kg对急性毒性无显著影响，但重复给药需控制总剂量＜5g/kg·周。建议临床采用"冲击-维持"给药模式：初始单次剂量100-200mg/kg，后续维持剂量≤50mg/kg，间隔时间＞72小时。

（二）给药周期优化
14天重复给药模型显示，给药周期与毒性呈剂量-效应关系。采用隔日给药方案可使总暴露量降低40%，同时保持抗炎活性＞85%（基于LPS诱导的TNF-α抑制率测定）。

（三）联合用药方案
实验表明，与EGCG联用可使Andro的细胞死亡率降低62%（p＜0.001），同时维持其抗IL-6（抑制率91%）和抗TNF-α（抑制率89%）活性。这种协同效应可能源于EGCG对ROS的清除作用（DAB染色显示活性氧减少78%）。

五、研究局限性及未来方向
（一）现有局限
1.未建立长期慢性毒性模型（＞6个月）
2.动物种属差异可能影响结果外推
3.未明确PANoptosis中zRNA的具体作用机制

（二）未来研究方向
1.开发基于PANoptosis通路的抑制剂（如GSDME单抗）
2.构建代谢组学-蛋白质组学联合分析平台
3.开展临床前药代动力学研究（重点监测肝脏代谢酶CYP2C9活性）

本研究首次揭示Andro的毒性具有显著的时空特异性：单次给药激活的快速凋亡通路（caspase-8主导）在24小时内完成损伤清除，而重复给药诱导的慢性PANoptosis（caspase-1/3-GSDME-MLKL级联）可造成持续3-5天的器官损伤。这种双重作用机制为中药现代化提供了重要理论支撑，提示在保留Andro抗炎疗效的同时，需通过智能给药系统（如纳米缓释载体）实现剂量精准调控。