体内碱基编辑技术成功挽救人源化小鼠模型中的常染色体显性多囊肾病

《Nature Communications》：In vivo base editing rescues ADPKD in a humanized mouse model

本研究针对常染色体显性多囊肾病（ADPKD）这一遗传性肾脏疾病，开发了基于AAV9递送的CRISPR/ABE9碱基编辑系统。研究人员通过构建广泛表达型和肾脏特异性启动子介导的双AAV-ABE9编辑器，在携带Pkd1RC/RC突变的人源化小鼠模型中，成功实现了致病点突变（R3277C）的高效校正。结果表明，单次给药即可显著延缓肾脏囊肿生长、改善心脏肥厚并延长模型鼠寿命，为ADPKD的基因治疗提供了新的策略。

　　

常染色体显性多囊肾病（Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease, ADPKD）是一种常见的遗传性肾脏疾病，主要由PKD1或PKD2基因突变引起。患者肾脏中会形成并充满大量充满液体的囊肿，这些囊肿会逐渐增大，挤压并破坏正常的肾脏组织，最终导致肾功能衰竭。除了肾脏病变，ADPKD还常伴有心脏肥厚等肾外并发症，严重影响患者的生活质量和寿命。目前，ADPKD尚无根治方法，现有的治疗手段主要是延缓疾病进展和管理并发症，因此，开发能够从根本上纠正致病突变的新疗法迫在眉睫。

近年来，CRISPR基因编辑技术的出现为遗传病的治疗带来了革命性的希望。其中，碱基编辑（Base Editing）技术尤为引人注目，它能够在不需要切断DNA双链的情况下，精准地将单个碱基转换成另一个碱基，从而修正致病点突变，安全性相对更高。腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）因其安全性较好、免疫原性较低且能实现长效基因表达，常被用作体内递送基因编辑工具的载体。然而，将碱基编辑技术应用于ADPKD的治疗，尤其是在活体（in vivo）水平实现高效且特异的基因校正，仍面临巨大挑战，其可行性和效果有待验证。

在此背景下，由Alice Shasha Cheng、Linda Xiaoyan Li、Julie Xia Zhou、Peter C. Harris、James P. Calvet和Xiaogang Li等研究人员组成团队，在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们旨在探索利用AAV9病毒递送先进的腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editor, ABE）——ABE9，在模拟人类ADPKD的Pkd1^RC/RC人源化小鼠模型中，进行体内基因治疗的可行性。该小鼠模型携带的Pkd1基因点突变（p.Arg3277Cys）会导致其编码的多囊蛋白1（Polycystin 1, PC1）功能异常，从而引发与人类ADPKD患者相似的肾脏囊肿和心脏肥厚等表型。

为了开展研究，研究人员运用了几个关键技术方法：他们首先构建了两种不同的双AAV9载体系统，分别由广泛表达的Cbh启动子和肾脏特异性表达的Ksp启动子驱动，用以递送ABE9碱基编辑器及其向导RNA（sgRNA），旨在靶向校正Pkd1基因中的致病点突变。研究使用了人源化的Pkd1^RC/RC和疾病进展更快的Pkd1^RC/null小鼠模型。他们通过静脉注射方式在不同 postnatal day (PN) 时间点（如PN7, PN14, PN28）对小鼠进行单次给药，并在给药后不同时间点（如3月龄、6月龄）通过高通量测序分析基因编辑效率，通过组织病理学（H&E染色、Masson三色染色等）、免疫组织化学/荧光、蛋白质印迹（Western Blot）、RT-qPCR、血液生化指标（如BUN、血清肌酐）检测以及生存分析等多种技术，系统评估了基因编辑治疗对肾脏、心脏、肝脏的病理表型、功能指标及小鼠生存期的改善效果，并深入分析了治疗的脱靶效应和安全性。

结果

开发双AAV编码的ABE9碱基编辑器

研究人员针对Pkd1基因中的R3277C点突变（导致精氨酸密码子AGA变为半胱氨酸密码子TGC），设计了一种策略，旨在利用ABE将TGC中的T纠正为C，从而使其变为精氨酸的另一个密码子CGC。他们构建了由广泛表达启动子（Cbh）驱动的双AAV9载体系统，分别携带ABE9编辑器的N端和C端片段，这些片段进入细胞后可通过蛋白质反式剪接 reconstitute 成有功能的完整编辑器。同时，他们设计了特异性的sgRNA来精准靶向突变位点。

广泛表达的Cbh-ABE9-dual-AAV9治疗延缓Pkd1^RC/RC小鼠的囊肿生长

研究发现，在Pkd1^RC/RC小鼠出生后第14天（PN14）或第28天（PN28）单次静脉注射不同剂量（1 x 10¹¹或 1 x 10¹²vg）的Cbh-ABE9-dual-AAV9，至3月龄时分析，可显著延缓肾脏囊肿的生长，表现为囊肿指数、肾重/体重比（KW/BW）、血尿素氮（BUN）和血清肌酐水平的降低。早期（PN14）给药的疗效优于晚期（PN28）给药。高剂量治疗在野生型小鼠和Pkd1^RC/+小鼠中未诱发肾脏囊肿或影响肾功能指标，表明治疗的安全性。基因编辑效率分析显示，在肾脏、心脏和肝脏中均检测到了成功的碱基校正，且高剂量PN14给药的编辑效率最高。Western Blot和qRT-PCR分析证实，治疗部分恢复了Pkd1基因的表达和PC1蛋白（尤其是PC1-NTR片段）的水平。

Cbh-ABE9-dual-AAV9治疗减轻Pkd1^RC/RC小鼠的心脏肥厚

ADPKD的基因突变也会导致心脏并发症，如左心室肥厚（LVH）。本研究证实，单次注射Cbh-ABE9-dual-AAV9同样能够减轻Pkd1^RC/RC小鼠的心脏肥厚，表现为心重/体重比（HW/BW）的降低。Western Blot和qRT-PCR分析显示，治疗组小鼠心脏中的PC1蛋白和Pkd1 mRNA水平均有所恢复。

Cbh-ABE9-dual-AAV9治疗的长期效果

为了评估治疗的长期有效性，研究人员观察了给药后6月龄的Pkd1^RC/RC小鼠。结果显示，单次PN14注射Cbh-ABE9-dual-AAV9能在长达6个月的时间内持续延缓囊肿生长和心脏肥厚，并改善肾功能。重要的是，基因编辑效率在6月龄时仍维持在较高水平，与3月龄时无显著差异，表明一次治疗可产生持久的遗传校正效果。

脱靶效应评估

为确保治疗的安全性，研究人员对Cbh-ABE9-dual-AAV9治疗的潜在脱靶效应进行了全面评估。他们在DNA水平分析了 bystander editing（邻近非目标碱基的编辑）和Cas9依赖的脱靶编辑，在RNA水平分析了全转录组的A-to-I（腺嘌呤到次黄嘌呤，在cDNA测序中体现为A-to-G）编辑。结果表明，ABE9编辑器具有高精度，未检测到显著的DNA或RNA水平的脱靶编辑事件。

建立肾脏特异性启动子介导的ABE9-AAV递送系统

为了实现更特异的肾脏靶向治疗，研究人员构建了由肾脏特异性cadherin-16（Ksp）启动子驱动的Ksp-ABE9-dual-AAV9系统。先导实验证实，AAV9-Ksp-EGFP主要在肾脏和肝脏中表达，在心脏中表达极低，且在肾脏中主要表达于肾小管上皮细胞。

Ksp-ABE9-dual-AAV9颗粒治疗延缓Pkd1^RC/RC小鼠的囊肿生长但不影响心脏

研究发现，单次PN14注射高剂量Ksp-ABE9-dual-AAV9能有效延缓Pkd1^RC/RC小鼠的肾脏囊肿生长，改善肾功能，其肾脏中的基因编辑效率甚至高于广泛表达的Cbh-ABE9系统。然而，正如所设计的，该治疗对心脏肥厚没有改善作用，且心脏中的编辑效率极低，成功实现了器官特异性的基因治疗。Western Blot证实治疗部分恢复了肾脏和肝脏中的PC1蛋白，但未恢复心脏中的PC1蛋白。

在原代肾小管细胞中验证编辑效率

从经治疗的小鼠肾脏中分离的原代肾小管细胞证实，两种AAV系统均能在目标细胞中有效校正突变，且Ksp启动子驱动的编辑器在肾小管细胞中的编辑效率更高。研究还发现，小鼠遗传背景（C57BL/6 vs 129）会影响碱基编辑的效率。

ABE9-dual-AAV9治疗改善肝功能且不引起肝毒性

尽管肝脏囊肿并非ADPKD的主要特征，但研究发现在Pkd1^RC/RC小鼠肝脏中存在轻度结构紊乱和囊肿，且肝功能指标（ALT、AST、ALP）有所升高。Cbh-ABE9-dual-AAV9治疗可恢复肝脏中Pkd1的表达和PC1蛋白水平，改善肝脏病理和功能指标，并减少肝脏中的免疫细胞（如CD45⁺、CD3⁺、CD4⁺T细胞和巨噬细胞）浸润。血液学参数分析表明，治疗剂量下的AAV未引起明显的免疫反应或肝毒性。

ABE9-dual-AAV9颗粒延长Pkd1^RC/null小鼠的寿命

在疾病进展更迅速、寿命极短（约25天）的Pkd1^RC/null小鼠模型中，PN7单次注射Cbh-ABE9-dual-AAV9或Ksp-ABE9-dual-AAV9均能显著延长小鼠的生存期。其中，肾脏特异性Ksp-ABE9-dual-AAV9治疗的效果更优，小鼠平均存活期延长至37天。治疗同时显著改善了20日龄小鼠的肾脏囊肿和功能指标，并提高了肾脏中PC1蛋白的水平。

AAV9-ABE9减少巨噬细胞募集和囊肿细胞增殖

ADPKD肾脏中，M2样巨噬细胞在囊肿周围和肾间质中大量募集，促进囊肿细胞增殖。本研究显示，两种AAV9-ABE9治疗均能减少Pkd1^RC/RC小鼠肾脏中巨噬细胞的积聚和囊肿内衬上皮细胞的增殖。

Cbh-ABE9-dual-AAV9和Ksp-ABE9-dual-AAV9减轻Pkd1^RC/RC小鼠的纤维化

器官纤维化是ADPKD的另一个重要病理特征。研究发现，两种治疗均能减轻3月龄和6月龄Pkd1^RC/RC小鼠的肾脏和肝脏纤维化。Cbh-ABE9-dual-AAV9治疗还能减轻心脏纤维化，而Ksp-ABE9-dual-AAV9治疗对心脏纤维化无影响，再次印证了其肾脏特异性。在Pkd1^RC/null小鼠中也观察到类似的对肾脏和肝脏纤维化的改善作用。

结论与讨论

本研究首次在ADPKD人源化小鼠模型中证实，通过AAV9递送ABE9碱基编辑器进行单次体内治疗，能够高效、精准地校正Pkd1基因的致病点突变，从而持久地延缓疾病在肾脏、心脏和肝脏中的进展，并显著延长模型动物的寿命。这项研究具有多重重要意义：首先，它验证了体内碱基编辑治疗单基因遗传性肾脏疾病的巨大潜力，为ADPKD及其他由点突变引起的遗传性肾病的治疗提供了新的思路和实验依据。其次，研究成功比较了广泛表达型和组织特异性启动子驱动的编辑器效果，证明肾脏特异性编辑器能在提高靶器官编辑效率的同时，减少对非靶器官的潜在影响，这为未来开发更安全、更精准的基因治疗策略提供了重要参考。第三，研究对治疗的脱靶效应和安全性进行了较为全面的评估，表明所使用的ABE9系统具有高精度和良好的安全性，缓解了人们对CRISPR基因编辑技术安全性的担忧。此外，研究观察到即使AAV载体拷贝数和Cas9蛋白表达随时间推移有所下降，已实现的基因编辑效果依然稳定，支持了“一击即走”（hit-and-go）的编辑模式，这有助于降低长期表达外源蛋白可能带来的风险。

当然，研究也存在一些局限性，例如长期表达Cas9和脱氨酶可能带来的潜在风险，以及高剂量AAV双载体递送可能引发的安全性问题。未来的研究可致力于开发更小巧、可被单个AAV包装的碱基编辑器，或探索非病毒递送系统（如脂质纳米粒），以推动该技术向临床应用转化。

总而言之，这项发表在《Nature Communications》上的工作是一项概念验证性研究，它有力地表明，基于CRISPR/ABE9的体内碱基编辑技术有望成为治疗ADPKD及其他遗传性疾病的强大工具，为相关领域的基因治疗发展奠定了坚实的基础。