CTCF通过耦联染色质远程环挤出与扩散机制调控免疫球蛋白κ轻链多样性的形成

《Nature Communications》：CTCF couples long-range loop extrusion and diffusion to mediate a diverse Igκ repertoire

本研究揭示了染色质架构蛋白CTCF通过其N-末端结构域协调染色质环挤出和扩散两种基因组折叠机制的新范式。研究人员发现CTCF一方面通过稳定黏连蛋白(cohesin)抵抗WAPL介导的释放，促进长距离环挤出以利用远端Vκ基因片段；另一方面通过形成环挤出屏障，为反向Vκ基因片段的倒位连接提供扩散基础。这种双重调控机制确保了免疫球蛋白κ轻链(IgK)位点能够高效完成跨越3.2 Mb的V(D)J重排，为抗体多样性提供了结构基础。该研究发表于《Nature Communications》，为三维基因组结构与免疫功能关联提供了重要理论依据。

　　

在B淋巴细胞发育过程中，V(D)J重排是产生抗体多样性的关键环节。这一过程需要RAG核酸酶将分布在数百万碱基对范围内的V、D、J基因片段进行精准重组。特别是在免疫球蛋白κ轻链(IgK)位点，3.2 Mb的基因组区域内分布着100多个Vκ基因片段，它们以正向和反向两种取向排列，分别通过缺失连接和倒位连接方式与Jκ片段重组。这种复杂的重组模式暗示着存在多种基因组折叠机制的协同调控。

长期以来，染色质环挤出和扩散被认为是三维基因组组织的两种基本机制。环挤出机制依赖黏连蛋白(cohesin)复合物沿染色质线性移动，形成逐渐增大的环状结构，这种机制具有方向性，特别有利于相同方向的基因片段连接。而扩散机制则通过随机运动使空间邻近的DNA序列发生碰撞，理论上不受方向限制，但效率随距离增加急剧下降。然而，这两种机制如何在IgK位点协调工作，以及它们对正向和反向Vκ片段使用的相对贡献，一直是领域内未解的核心问题。

为了解决这一难题，密歇根州立大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新发现。他们聚焦于染色质架构蛋白CTCF，该蛋白已知通过其N-末端与黏连蛋白相互作用，既能作为环挤出的屏障，又可能影响黏连蛋白的稳定性。研究人员推测CTCF可能是连接这两种基因组折叠机制的关键分子。

研究团队首先通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了CTCF N-末端关键YDF motif突变(CTCF-Nm)的v-Abl前B细胞系。这种突变特异性地破坏了CTCF与黏连蛋白的极性相互作用，但不影响CTCF的DNA结合能力。通过高通量基因组范围易位测序适应的V(D)J测序(HTGTS-V(D)J-Seq)分析，他们发现CTCF-Nm突变导致远端Vκ片段使用显著减少，而近端缺失连接的Vκ片段使用增加，倒位连接的Vκ片段使用则受到抑制。

为确认这种效应确实源于Vκ基因片段的重组信号序列(RSS)取向而非序列本身特性，研究人员进行了巧妙的基因座倒位实验。他们将377 kb的近端Vκ区域整体倒置，发现原本正向的Vκ片段在变为反向取向后，其使用频率大幅下降；而原本反向的Vκ片段在变为正向取向后，使用频率显著增加。这一结果强有力地证明，在CTCF N-末端功能受损的情况下，Vκ片段的连接效率主要由其RSS取向决定。

通过染色体构象捕获测序(3C-HTGTS)和染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)分析，研究人员发现CTCF-Nm突变导致IgK位点的长程染色质相互作用显著减少，黏连蛋白在染色质上的滞留能力下降。定量质谱分析进一步揭示，突变细胞中CTCF与黏连蛋白的相互作用减少了3倍，而黏连蛋白与释放因子WAPL的相互作用增加了1.9倍，这解释了长程环挤出受损的分子机制。

有趣的是，当研究人员在CTCF-Nm细胞中通过auxin-inducible degron (AID)系统降解WAPL以增强环挤出活性时，远端缺失连接的Vκ使用得到恢复，但倒位连接的Vκ使用仍未改善。这表明单纯的环挤出增强不足以支持倒位连接，提示CTCF的屏障功能对倒位Vκ连接至关重要。

最令人信服的证据来自于人工模拟CTCF屏障的实验。研究人员在Vκ-Jκ间隔区插入了38个dCas9结合位点，并利用dCas9-SunTag系统在该位置建立人工屏障。这一干预显著恢复了CTCF-Nm细胞中的倒位Vκ连接，证明环挤出屏障的存在是促进扩散介导的倒位连接的关键因素。

本研究主要采用了以下关键技术：CRISPR/Cas9基因编辑构建突变细胞系、HTGTS-V(D)J-Seq分析Vκ使用频率、3C-HTGTS分析染色质空间互作、ChIP-Seq分析蛋白与染色质结合、定量质谱分析蛋白相互作用、PRO-Seq分析转录活性、以及dCas9-SunTag系统建立人工染色质屏障。

CTCF N-末端突变损害远端Vκ利用并差异影响近端缺失和倒位Vκ连接

通过HTGTS-V(D)J-Seq分析，研究发现CTCF-Nm突变导致中间和远端Vκ使用减少，同时近端缺失连接Vκ使用增加而倒位连接Vκ使用减少，表明CTCF N-末端对长程Vκ使用和倒位Vκ连接均有重要调控作用。

Vκ-RSS取向决定CTCF N-末端突变体中的Vκ重组活性

通过377 kb区域倒位和单个Vκ6-17精确倒位实验，证实Vκ片段的连接效率主要取决于其RSS取向而非序列特性，在CTCF-Nm背景下，取向是决定重组活性的主要因素。

CTCF N-末端突变损害IgK位点的环调控

3C-HTGTS显示CTCF-Nm细胞长程染色质相互作用减少，ChIP-Seq显示黏连蛋白染色质结合减少，定量质谱证实CTCF与黏连蛋白相互作用减少而黏连蛋白与WAPL相互作用增加，表明CTCF N-末端通过稳定黏连蛋白促进长程环挤出。

WAPL缺失在CTCF-Nm细胞中挽救远端缺失连接而非倒位连接

在CTCF-Nm细胞中诱导WAPL降解可恢复长程染色质相互作用和远端缺失Vκ使用，但不能恢复倒位Vκ使用，证明环挤出足以介导缺失连接但不足以支持倒位连接。

CTCF环屏障功能是倒位Vκ连接所必需的

比较WAPL单独缺失和WAPL缺失加CTCF-Nm细胞，发现保留CTCF屏障功能的细胞能维持倒位Vκ连接，而CTCF-Nm细胞则不能，强调CTCF屏障对倒位连接的重要性。

靶向dCas9-SunTag屏障挽救倒位Vκ连接

在Vκ-Jκ间隔区靶向植入dCas9-SunTag人工屏障，可显著恢复CTCF-Nm细胞中的倒位Vκ连接，直接证明环挤出屏障对促进倒位连接的关键作用。

本研究系统阐明了CTCF通过双重机制协调染色质环挤出与扩散的新范式。一方面，CTCF通过其N-末端稳定黏连蛋白，抵抗WAPL介导的释放，促进长程环挤出，使远端Vκ片段能够与Jκ片段接近；另一方面，CTCF通过形成极性屏障，阻止直接的Vκ-to-Jκ挤出，为扩散介导的取向无关性相互作用创造条件。这种精巧的协调机制确保了IgK位点能够高效利用正向和反向Vκ片段，生成多样化的抗体 repertoire。

该研究不仅解决了免疫学领域关于IgK位点重组机制的长久疑问，更重要的是揭示了三维基因组组织的基本原理。CTCF作为基因组架构的核心调控因子，通过耦联不同的染色质折叠机制，实现了对复杂生物学过程的精确调控。这一发现可能对理解其他依赖长程基因组相互作用的生物学过程，如转录调控和DNA修复，具有重要启示意义。