Ran调控Importinβ表面变构通讯的分子机制

《Nature Communications》：Ran modulates allosteric crosstalk between importin β surfaces

本研究针对Ran-GTP调控Importinβ与FG-nups结合亲和力及解离import复合物的分子机制这一长期悬而未决的问题，通过冷冻电镜单颗粒分析技术解析了Importinβ与不同效应物结合的五个构象状态。研究发现Ran-GTP通过变构作用改变Importinβ的曲率，关闭其外表面FG结合口袋，揭示了核输入过程中受体调控的新机制，为理解β-核转运蛋白家族的转运机制提供了重要结构基础。

　　

细胞核作为真核细胞的控制中心，其与细胞质之间的物质交换需要通过核孔复合物（NPC）这一精密通道。在这一过程中，Importinβ作为典型的核输入受体，负责将含有核定位信号（NLS）的蛋白质货物转运进入细胞核。这一过程的核心调控者是小型GTP酶Ran，它在细胞核内以Ran-GTP形式富集，在细胞质中以Ran-GDP形式存在。Ran-GTP梯度为核质转运提供了方向性，但几十年来，科学家们一直对两个关键机制感到困惑：Ran-GTP如何降低Importinβ对苯丙氨酸-甘氨酸富集核孔蛋白（FG-nups）的亲和力，从而促进import复合物通过核孔的选择性屏障而不是堵塞核孔？又是如何解离import复合物，将货物释放到核内？

为了解决这些长期存在的科学问题，来自美国阿拉巴马大学伯明翰分校等机构的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。研究人员巧妙地运用冷冻电子显微镜（cryo-EM）单颗粒分析技术，在接近生理条件下解析了Importinβ与不同效应物结合的五个构象状态，包括与IBB结构域（代表import货物）、FG重复序列、Ran-GTP、Ran-GTP:RanBP1以及Ran-GDP:RanBP1的复合物结构。

研究团队主要采用了冷冻电镜单颗粒分析这一关键技术，通过分子克隆、蛋白质表达与纯化获得高质量的蛋白质复合物样品，利用300 kV Krios显微镜进行数据收集，并通过cryoSPARC软件进行数据处理和三维重构，最终获得分辨率在2.6-3.4 ?之间的高精度结构模型。

aIBB和xIBB稳定不同的importinβ构象

研究人员首先解析了Importinβ与importin α1的IBB结构域（aIBB）以及XRIPα的IBB结构域（xIBB）的复合物结构。有趣的是，这两种IBB结构域虽然都具有高度碱性特征，但它们稳定了Importinβ不同的构象状态。xIBB结合的Importinβ构象比aIBB结合的构象延长约9 ?，表明Importinβ的螺线管结构具有显著的构象可塑性。

七个FG重复序列结合importinβ外表面

通过解析Importinβ:aIBB与FG-rich核孔蛋白Nsp1的复合物结构，研究人员在Importinβ的凸面鉴定了五个主要的FG结合口袋。这些口袋分布在HEAT重复序列H4-H6、H6-H7、H7-H8、H9-H10和H16-H17之间，其中H5-H6之间的口袋是之前已被鉴定的主要FG结合位点。重要的是，FG结合并不引起Importinβ螺线管结构的显著变化，说明FG重复序列更像是分子魔术贴，装饰在Importinβ外表面而不引起受体结构的重大改变。

Ran-GTP关闭importinβ螺线管

最令人惊讶的发现来自于Importinβ:Ran-GTP复合物的结构。与之前基于酵母Kap95p:Ran-GTP晶体结构提出的模型相反，Ran-GTP并非打开Importinβ的C端，而是使其螺线管结构更加闭合，形成一个球状组装体。Importinβ通过三个接触点与Ran-GTP结合，导致其N-to-C距离比aIBB结合构象缩短约15 ?。这一闭合构象与之前报道的晶体结构存在显著差异（RMSD达7.4 ?），主要是由于晶体堆积效应导致的人为假象。

RanBP1插入importinβ和Ran-GTP之间

Importinβ:Ran-GTP:RanBP1三元复合物的结构显示，RanBP1插入到Importinβ和Ran-GTP的界面之间，主要与Ran-GTP的外表面结合。RanBP1的结合削弱了Importinβ与Ran-GTP在两个接触点的相互作用，导致Importinβ螺线管松弛并延伸，构象甚至比xIBB结合时更为开放。

importinβ与Ran-GDP:RanBP1复合物具有松散C端

在Importinβ:Ran-GDP:RanBP1复合物中，只有Importinβ的N端HEAT重复序列1-10可见密度，C端HEAT重复序列11-19由于运动性而无法在重构中观察到。这表明该复合物中Importinβ的C端具有高度灵活性，可能类似于未结合的Importinβ状态。

Ran-GTP结合importinβ关闭FG结合口袋

通过比较不同复合物中FG结合口袋的体积和溶剂可及表面积，研究人员发现Ran-GTP、Ran-GTP:RanBP1和Ran-GDP:RanBP1的结合都会导致Importinβ外表面关键FG结合口袋的显著缩小。特别是位于H4-H6和H9-H10的两个口袋体积明显减小，这从结构上解释了Ran-GTP如何降低Importinβ对FG-nups的亲和力。

生化验证FG结合亲和力变化

通过体外pull-down实验，研究人员验证了结构观察到的现象。Ran-GTP和Ran-GTP:RanBP1都能显著降低Importinβ与不同FG-nups（Nup358、Nup62和Nup153）的结合，而Ran-GDP单独存在时则不影响这种结合。有趣的是，Ran-GDP与RanBP1一起使用时，对Importinβ与FG-nups的结合只有轻微影响。

IBB和Ran-GTP结合importinβ的不同区域

结合界面分析显示，IBB结构域主要与Importinβ的C端区域（HEAT 7-19）结合，而Ran-GTP则主要结合N端区域（HEAT 1-13），两者仅在HEAT 13有部分重叠。这种结合位点的分离为理解Ran-GTP如何变构调控货物释放提供了结构基础。

本研究通过系统的结构生物学和生化分析，揭示了Importinβ在核输入过程中构象动态变化的完整图景。研究发现Ran-GTP并非通过打开Importinβ的C端来释放货物，而是通过变构机制改变Importinβ的曲率，关闭其外表面的FG结合口袋，同时通过构象变化破坏IBB结构域与C端HEAT重复序列的结合。这一机制确保了import复合物能够顺利通过核孔屏障，并在适当的位置释放货物。研究还阐明了RanBP1在调控Importinβ构象和功能中的重要作用，特别是其能够促进形成一种既能保持货物结合又具有降低FG亲和力的过渡态复合物。

这项研究不仅解决了核质转运领域长期存在的关键科学问题，而且为理解整个β-核转运蛋白家族的转运机制提供了重要的结构框架。研究所揭示的变构调控机制可能普遍适用于其他核转运受体，为开发针对核质转运异常相关疾病的治疗策略提供了新的思路。