胰岛素信号通路依赖的DAF-16/FOXO核转位脉冲在秀丽隐杆线虫生长中的全身同步性研究

《Nature Communications》：Body-wide synchronization of insulin-signaling dependent DAF-16/FOXO nuclear translocation pulses correlated with C. elegans growth

本研究针对胰岛素信号在生物体水平协调生长的动力学机制这一空白，通过显微成像技术实时观测了秀丽隐杆线虫在应激状态下关键转录因子DAF-16/FOXO的核转位动态。研究发现，DAF-16/FOXO在恒定应激下呈现随机但高度同步的脉冲式核转位，其脉冲特征（频率、持续时间）与幼虫生长停滞密切相关，且该同步现象在不同应激类型中保守存在。这项工作揭示了胰岛素信号通路协调全身生长的动态新机制，为理解糖尿病、肥胖等胰岛素相关疾病的组织协调性失调提供了新视角。

　　

在生命科学领域，胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路是调控机体生长、代谢和寿命的核心通路。当面临饥饿、高温或渗透压变化等不利条件时，该通路的关键转录因子FOXO会从细胞质转移到细胞核内，启动一系列应激反应基因的表达，从而使机体暂停生长以应对挑战。以模式生物秀丽隐杆线虫为例，其唯一的FOXO同源蛋白DAF-16的核定位长期以来被视为胰岛素信号活性的重要指标。然而，一个长期困扰科学家们的谜团是：即使在完全相同的恒定应激条件下，群体中仍有相当大比例的线虫幼虫并未显示出明显的DAF-16核定位。这种个体间的巨大差异暗示着我们对象胰岛素信号这样的核心通路在活体中的动态行为知之甚少。传统的静态观察方法无法捕捉其动态变化过程，而生物体全身细胞如何协调一致地对环境信号做出反应，更是一个悬而未决的基本生物学问题。

为了解开这些谜团，发表在《Nature Communications》上的一项研究首次在活体动物中实时、高分辨率地观测了胰岛素信号关键步骤——DAF-16/FOXO核转位的动态过程。研究人员通过将刚孵化的秀丽隐杆线虫L1期幼虫置于特制的微流体培养室中，利用长时间活体成像技术，在细胞水平上追踪了全身范围内DAF-16::GFP荧光融合蛋白的定位变化。

研究的关键技术方法主要包括：利用微加工技术制备水凝胶微腔室阵列，实现对单个线虫幼虫的长期培养和成像；构建表达DAF-16::GFP的转基因秀丽隐杆线虫株系（包括内源性CRISPR/Cas9敲入株），用于实时监测蛋白定位；采用自定义Python软件进行图像分析，自动分割肠道细胞核与细胞质区域，并量化核质荧光强度比；通过温度控制系统实现高时间分辨率的热应激干预；应用交叉相关分析和蒙特卡洛模拟来精确量化细胞间的脉冲延迟。

同步化的、随机的DAF-16/FOXO核转位脉冲

令人惊讶的是，在恒定应激（如饥饿）下，DAF-16::GFP并非持续停留在核内，而是在细胞核和细胞质之间以脉冲方式穿梭。每个脉冲持续约1小时，且这种脉冲行为在个体间表现出显著的随机性。然而，更令人惊奇的是，尽管脉冲的出现是随机的，但在同一个体内，所有表达DAF-16的细胞（如肠道细胞、头部肌肉细胞、尾部皮下细胞）中的核转位事件却呈现出高度同步性，脉冲几乎同时发生。这种同步现象在转基因株和内生标签株中均被观察到，并也在年轻成虫饥饿时出现，表明这是DAF-16对饥饿应激的普遍响应特征。甚至在人类U2OS细胞中，其FOXO同源蛋白FOXO3A在血清饥饿后也显示出类似的核转位脉冲，提示这是一种从线虫到哺乳动物保守的调控模式。

DAF-16/FOXO转位脉冲的同步性不依赖于应激类型

研究进一步探讨了不同应激类型（渗透压冲击、热激）下的DAF-16动态。结果表明，无论是200-400 mM NaCl的渗透压胁迫，还是31-33°C的热激，都能诱发同步的DAF-16核转位脉冲，但脉冲的动态特征因应激类型和强度而异。渗透压冲击下，脉冲短促且孤立；热激则通常引发一个强烈的瞬时脉冲。高时间分辨率（30秒）成像揭示，脉冲在不同肠道细胞间的延迟极小（<3分钟）。在饥饿条件下，脉冲从前肠（如Int2细胞）向后肠（如Int8细胞）传播，有约3分钟的延迟；而在渗透压胁迫下，延迟模式更为复杂，部分体现了背腹轴的顺序。这表明同步机制可能部分依赖于应激类型。

DAF-16/FOXO转位动力学反映应激类型和强度

通过比较群体平均的核定位动态和自相关分析，研究发现饥饿诱导的脉冲呈现类振荡特征，而渗透压冲击下的脉冲则更随机。增加应激强度（如更高的NaCl浓度或温度）会延长DAF-16在核内的停留时间，但不改变脉冲幅度。特别是在33°C热激下，DAF-16会持续位于核内。这些结果表明DAF-16的转位动力学不仅能区分不同的应激类型，也能敏感地反映应激的强度。

DAF-16/FOXO调控因子的突变改变转位脉冲动力学

为了探究脉冲产生的分子机制，研究人员检测了胰岛素信号通路核心组分（daf-2胰岛素受体突变体、akt-1激酶突变体）以及能量感应激酶AMPK（aak-1; aak-2双突变体）对脉冲动态的影响。结果显示，这些突变体仍然表现出同步的DAF-16脉冲，但脉冲的特征发生了改变。daf-2(e1368)突变体脉冲持续时间更长，DAF-16主要位于核内；akt-1(ok525)突变体脉冲最低值升高；而抑制AKT-1活性的pptr-1(tm3103)突变体脉冲持续时间和幅度均减小。AMPK缺失在食物耗尽（饥饿模型）时显著降低了脉冲的持续时间和幅度，但在渗透压胁迫下影响较小。这表明胰岛素信号和AMPK等通路共同调控着DAF-16脉冲的持续时间、频率和幅度等参数。

DAF-16/FOXO脉冲与体细胞生长停滞相关

研究将焦点转向DAF-16脉冲的生理功能，特别是与L1期滞育核心特征——生长停滞的关系。通过精确测量体长变化，发现在200 mM NaCl的轻度渗透压胁迫下，生长速率与DAF-16核定位时间占比呈强负相关。个体动物在DAF-16脉冲期间生长停滞，脉冲间歇期恢复生长。然而，在daf-2突变体中，尽管DAF-16核定位水平更高，但其生长停滞所需的阈值也相应提高，说明生长停滞并非简单地由核DAF-16的水平决定。更重要的是，daf-16(mu86)功能缺失突变体在渗透压或热激胁迫下无法完全停滞生长，证实DAF-16是应激诱导生长停滞所必需的。

应激动力学对DAF-16转位及靶基因表达的影响

通过施加交替的热激（如33°C）与常温（20°C）间隔处理，研究发现DAF-16::GFP的核转位能够快速响应温度变化。有趣的是，在某些个体中，热激间隔结束后仍会出现额外的DAF-16转位脉冲，类似于可激发系统的行为。进一步检测DAF-16的靶基因表达（如sod-3::GFP和hsp-16.2::GFP）发现，将相同的总热激时间分割成更短、更频繁的脉冲式施加，能更有效地诱导靶基因表达，且这种诱导依赖于DAF-16。这表明动态的DAF-16核转位脉冲可能比持续核定位更有效地调控基因表达。

综上所述，这项研究首次揭示了在活体生物中，胰岛素信号通路的关键转录因子DAF-16/FOXO以高度同步的脉冲方式动态穿梭于核质之间，而非传统认为的简单“开/关”状态。这种脉冲动态不仅具有应激类型和强度特异性，更与机体是否决定暂停生长这一重大生理决策紧密相关。该发现挑战了对胰岛素信号通路运作模式的静态理解，强调了动态分析在理解生物系统复杂性中的重要性。全身同步的脉冲机制为解释生物体如何协调各组织细胞以维持均匀生长提供了新思路，并对理解人类糖尿病、肥胖等胰岛素相关疾病中可能存在的组织间协调失灵现象具有深远启示。未来研究将致力于揭示驱动这种全身同步性的分子信号，并探索FOXO脉冲动态在高等生物生理病理过程中的普遍性及其调控机制。