高分辨率解析人T细胞白血病病毒衣壳蛋白揭示未成熟颗粒形态新机制

《Nature Communications》：High-resolution analysis of the human T-cell leukemia virus capsid protein reveals insights into immature particle morphology

本研究通过冷冻电镜和冷冻电子断层扫描技术，首次以3.4埃分辨率解析了HTLV-1未成熟病毒颗粒的衣壳蛋白晶格结构，揭示了其独特的CA-NTD三聚体和CA-CTD二聚体界面稳定机制。研究发现IP6对HTLV-1未成熟颗粒组装非必需，且病毒颗粒呈现显著的形态异质性，为理解δ逆转录病毒组装机制及开发靶向疗法提供了重要结构基础。

　　

在病毒学领域，人T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）作为一种δ逆转录病毒，一直是科研人员关注的焦点。这种病毒不仅是成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATLL）和HTLV-1相关脊髓病/热带痉挛性截瘫（HAM/TSP）的致病元凶，更令人担忧的是，目前尚无获批的特效药能够预防或治疗HTLV-1感染。与人类免疫缺陷病毒（HIV）类似，HTLV-1编码的结构多蛋白Gag在病毒组装过程中扮演着关键角色，其中衣壳蛋白（CA）域更是决定Gag多聚化的核心因素。

尽管科学家们已经对多种逆转录病毒的CA蛋白结构进行了深入研究，发现其三级结构在氨基酸序列差异较大的情况下仍高度保守，但HTLV-1未成熟颗粒的形态特征却显得与众不同。早期的二维成像研究表明，HTLV-1未成熟颗粒通常具有不完整的Gag晶格，部分区域甚至偏离病毒膜的曲率，呈现扁平化特征。然而，这些观察结果是否仅为二维成像的假象，以及HTLV-1未成熟晶格曲率的详细特征，始终是悬而未决的科学问题。

更令人困惑的是，HTLV-1与HIV-1在病毒组装机制上存在明显差异。对于HIV-1而言，CA-CTD和SP1是病毒组装的主要驱动力，而CA-NTD对于未成熟晶格的形成并非必需。然而，HTLV-1的研究却显示了相反的情况——CA-NTD是正确晶格形成所必需的，而CA-CTD的突变对未成熟晶格形成的影响有限。这种差异背后的结构基础亟待阐明。

此外，肌醇六磷酸（IP6）作为逆转录病毒组装中的重要辅因子，在HIV-1等慢病毒的生命周期中发挥着至关重要的作用。IP6能够通过静电作用与带正电荷的氨基酸残基结合，稳定未成熟和成熟的病毒核心结构。然而，IP6在δ逆转录病毒（如HTLV-1）颗粒组装和成熟过程中的功能，至今仍属未知领域。

为了解答这些科学问题，由William G. Arndt领衔的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。研究人员综合运用冷冻电镜单颗粒分析（cryo-EM SPA）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术，对HTLV-1未成熟病毒颗粒进行了高分辨率结构解析和形态学分析。

研究团队采用的关键技术方法包括：通过HEK293T细胞系共表达HTLV-1 Gag和Env蛋白生产病毒样颗粒；利用梯度离心技术纯化病毒颗粒；采用冷冻电镜单颗粒分析获得高分辨率结构；运用冷冻电子断层扫描进行三维形态学分析；结合分子动力学模拟研究IP6结合特性；通过位点定向突变验证关键残基功能；使用体外组装实验分析CA蛋白自组装能力。

Cryo-EM reconstruction of the immature HTLV-1 Gag lattice

研究人员通过单颗粒分析成功解析了HTLV-1未成熟CA晶格的结构，全局分辨率达到3.4埃。重建结果揭示，该晶格通过NTD间的三聚体界面和CTD间的二聚体界面共同稳定。局部分辨率计算显示CA-NTD的分辨率高于CA-CTD，表明CTD区域存在一定柔性。3DFlex精修结果进一步展示了CA-CTD相对于CA-NTD的灵活性，这种灵活性源于未成熟晶格中不同的曲率变化。

Morphology of the HTLV-1 immature Gag lattice

结构分析表明，HTLV-1未成熟Gag晶格与其它逆转录病毒有着显著不同的形态特征。与HIV-1等病毒典型的"高脚杯"形态不同，HTLV-1的CA-NTD在六聚体中心形成紧密的孔道，构象类似于成熟逆转录病毒CA晶格中的NTD结构。特别值得注意的是，HTLV-1 Gag晶格中不存在类似HIV-1的6螺旋束（6HB）结构，CA-CTD在同一六聚体内没有显著的界面和分子间接触。

Mutations in the CTD dimer interface are detrimental to particle production

通过结构引导的丙氨酸突变研究，研究人员发现CA-CTD二聚体界面中的关键残基对病毒颗粒生产至关重要。W133（310螺旋）和I168（螺旋8）的突变严重降低了颗粒产量，而L172（螺旋8）的突变使产量减少了两倍。这些观察结果表明，310螺旋和螺旋8顶部之间形成了一个疏水口袋，类似于HIV-1 CA-CTD中的疏水口袋。此外，S175的突变也显著削弱了颗粒生产，而Y174的突变导致未成熟颗粒产量两倍降低。

Cryo-ET reveals incomplete and heterogeneous immature Gag lattice morphologies

冷冻电子断层扫描分析揭示了HTLV-1颗粒中不完全和异质的Gag晶格形态。基于推导的CA六聚体坐标和角度，局部平均曲率估计显示即使在同一个病毒颗粒内，局部曲率也存在显著变化，半径范围从28纳米到75纳米不等。CA层到膜的平均距离为16.3±2.49纳米，分布略向右偏斜，可能代表了那些明显远离膜的晶格区域。

IP6 is dispensable for immature HTLV-1 particle production and lattice formation

研究发现，IP6对HTLV-1未成熟颗粒的生产和晶格形成并非必需。虽然在CA-NTD六聚体中心孔观察到一个微弱的球形密度，但其强度远低于其他逆转录病毒未成熟CA重建中的IP6密度。分子动力学模拟显示，IP6可以被R13和K18高度配位。体外实验证实IP6和苯六甲酸能显著增强HTLV-1 CA的组装，但IP6耗竭实验表明，在IPPK KO和IPMK KO细胞中过表达MINPP1并不影响HTLV-1未成熟颗粒的生产。

研究结论与讨论部分强调了HTLV-1与HIV-1未成熟晶格结构的比较分析为理解其形态差异的分子决定因素提供了重要见解。尽管HTLV-1和HIV-1晶格组织存在巨大差异，但它们的三级结构高度保守，都由CA-NTD中的三聚体界面和CA-CTD中的二聚体界面组成。

值得注意的是，HTLV-1未成熟晶格的组织方式——特别是6HB的缺失以及未成熟CA-NTD采用类成熟构象——暗示HTLV-1可能经历特殊的成熟过程。CA-NTD的类成熟组织方式表明其在成熟过程中可能经历较小的结构重组，这与HIV-1成熟过程中CA-NTD的大规模结构改变形成鲜明对比。

IP6在HTLV-1组装中的非必需性是一个意外发现，特别是在IP6能显著增强纯化HTLV-1 CA体外组装的情况下。一种可能的解释是NC结构域在促进HTLV-1 Gag寡聚化中的作用。先前在不存在IP6但存在NC和核酸的情况下进行的HTLV-1 CA螺旋管体外组装研究表明，在没有核酸与NC结合促进组装的情况下，HTLV-1 CA可能需要更高水平的IP6来成核组装。

高分辨率SPA和断层扫描成像的结合为HTLV-1未成熟晶格中观察到的显著异质性提供了合理解释。断层扫描分析显示的大范围局部曲率变化，以及先前报道的晶格扁平化区域，可能是HTLV-1未成熟晶格功能性的后果——该晶格仅在CA-NTD中具有六聚体内相互作用，而在CA-CTD中没有。

这项研究代表了迄今为止对HTLV-1未成熟颗粒最详细的结构和形态学分析，不仅增进了我们对HTLV-1颗粒多形性本质的理解，也为揭示治疗靶点提供了重要线索。特别是CA-CTD二聚体界面中关键残基的鉴定，为开发针对HTLV-1组装过程的干预策略指明了方向。