基于基因编辑与人工性染色体技术的白纹伊蚊性别分离新策略

《Nature Communications》：Mosquito sex separation using complementation of selectable traits and engineered neo-sex chromosomes

本研究针对蚊媒遗传防治中雌雄分离效率低下的难题，开发了一种将CRISPR/Cas9介导的可筛选性状（黄色体色）与nix基因驱动的性别转换相结合的遗传性别分离品系（GSS）。研究人员通过精准敲除白纹伊蚊yellow基因获得稳定突变体，并利用携带nix与mini-yellow的转基因实现雄性特异性表型恢复，成功构建出雌蚊呈黄色、雄蚊呈深色的纯系品系。该品系不仅具备肉眼可辨的体色差异，还表现出增强的雄性早现现象（protandry）和雌虫卵粒抗干燥能力减弱等附加优势，为大规模蚊媒防控提供了可扩展的技术平台。

　　

在全球蚊媒传染病防控战中，白纹伊蚊（Aedes albopictus）作为登革热、寨卡病毒等重要病原体的传播媒介，其扩散能力与抗药性提升持续加剧公共卫生负担。传统杀虫剂与环境治理手段效果有限，促使遗传控制技术成为研究热点。这类技术核心依赖于大量释放不育雄蚊以压制野生种群，但雌蚊混入会导致疾病传播风险加剧并干扰防控效果。现有雌雄分离技术主要依赖蛹期体型差异筛选，存在效率低、成本高、易出错等瓶颈，亟需开发精准可控的遗传解决方案。

为突破这一技术壁垒，Doron S.Y. Zaada团队在《Nature Communications》发表研究，提出了一种整合基因编辑与人工性染色体工程的性别分离新范式。该研究以白纹伊蚊为模型，通过CRISPR/Cas9靶向修饰调控体色形成的yellow基因，并巧妙利用雄性决定因子nix构建性别转换系统，最终实现了雌雄蚊的精准可视化分离。

研究团队首先通过胚胎显微注射CRISPR核糖核蛋白复合物（RNP），成功获得yellow基因纯合突变体。该突变体表现为幼虫角质层黑素沉积缺陷、蛹期背板色浅、成蚊“虎纹”变黄以及卵粒呈金棕色等典型表型。为建立性别关联的筛选标记，团队设计了两类微型yellow回补载体：EnYR（使用内源启动子）和HspYR（采用热休克蛋白hsp83启动子）。转基因测试表明，仅HspYR能有效恢复黑化表型，证实hsp83启动子可驱动足够表达量。

关键创新点在于将nix基因整合至HspYR载体，构建出YRN（yellow rescue with nix）系统。该载体注射至野生型胚胎后，通过多代回交筛选获得YRN-6纯系品系。该品系雄蚊完全依赖转基因nix实现性别决定（伪雄蚊，pseudomales），且携带mini-yellow恢复深色表型；雌蚊则因缺失转基因而保持黄色突变表型。分子鉴定证实伪雄蚊缺乏内源M基因座，RNA-seq分析显示其性偏基因表达谱与野生雄蚊高度相似，包括doublesex（dsx）和fruitless（fru）等关键性别决定基因的正确剪接。

表型验证环节发现，GSS品系蛹期体色差异显著（雌蚊色浅、雄蚊色深），结合体型参数可提升分选准确率。更值得注意的是，GSS雌蚊幼虫发育延迟，使雄蚊早现指数从野生型的17.4提升至27.8，扩宽了性别分选时间窗。交配实验表明伪雄蚊诱导雌蚊交配后拒避反应的能力与野生雄蚊相当。此外，GSS雌蚊所产卵粒因缺乏黑化保护而具干燥敏感性，这一特性可降低意外释放雌蚊的野外定殖风险。

关键技术方法包括：1) 利用CRISPR/Cas9-RNP系统敲除yellow基因；2) 构建piggyBac转座子载体实现hsp83-mini-yellow与nix的整合表达；3) 通过多代回交与分子鉴定筛选无M基因座的伪雄蚊品系；4) 采用RNA-seq分析性别偏基因表达；5) 结合图像分析与发育动力学评估分选效率。

结果章节概要

生成黄色突变体作为可筛选性状：成功建立yellow基因纯合突变品系，突变体呈现黑素沉积缺陷的连续表型，为性别分离提供可视化标记。

转基因回补黄色表型：HspYR载体通过hsp83启动子驱动mini-yellow表达，完全恢复突变体黑化表型，而内源启动子载体EnYR无效。

结合性别转换与黄色回补：YRN-6品系实现雄性特异性表型恢复与性别转换，伪雄蚊缺乏内源M基因座且生育力正常。

GSS伪雄蚊的基因表达 masculinization：伪雄蚊性偏基因表达模式与野生雄蚊高度一致，但11个M基因座连锁基因未表达。

黄色GSS的性别分选效能评估：体色与体型双参数显著提升分选精度，发育延迟增强雄蚊早现效应。

GSS卵粒的干燥敏感性：yellow突变导致卵壳黑化缺陷，使GSS卵粒存活率随存储时间急剧下降，可作为生物安全特性。

研究结论指出，该GSS平台首次实现基于内源基因的蚊虫性别连锁筛选性状，兼具可视化标记、发育调控与生物安全三重优势。讨论部分强调，nix介导的性别转换避免了传统易位染色体技术的生育力代价与Y染色体异染色质环境的影响，为其他昆虫的遗传性别分离提供了可推广策略。未来通过引入温度敏感致死性状或自动化分选技术，可进一步优化该系统的规模化应用潜力。