靶向外膜蛋白OmpV的小分子抑制剂C607-0736可有效抑制霍乱弧菌感染

《Nature Communications》：Small molecule inhibitor targets OmpV to treat pandemic Vibrio cholerae infection

本研究针对多重耐药霍乱弧菌(V. cholerae)感染的防治难题，揭示了外膜蛋白OmpV在细菌致病过程中的关键作用。研究人员通过计算机辅助药物设计(CADD)筛选出小分子抑制剂C607-0736，该化合物能特异性阻断OmpV介导的细菌粘附和细菌胞外囊泡(BEVs)内化，显著降低霍乱毒素(CT)向宿主细胞的递送。动物实验证实C607-0736可有效抑制O1/O139血清型霍乱弧菌及含ompV基因的副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)的肠道定殖。该研究为开发针对霍乱弧菌等病原体的新型抗感染策略提供了重要理论基础。

　　

霍乱，这种由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的严重腹泻性疾病，几个世纪以来一直是全球公共卫生的重大威胁。自1817年以来，人类已遭受七次霍乱大流行的侵袭。其中，O1和O139血清型霍乱弧菌是引起大流行的主要元凶。尽管口服补液盐和抗生素是治疗霍乱的主要手段，但全球细菌抗生素耐药性问题日益严峻，特别是多重耐药霍乱弧菌的出现，使得开发新的预防和治疗策略迫在眉睫。

在这一背景下，研究人员将目光投向了霍乱弧菌的外膜蛋白OmpV。外膜蛋白在细菌感染过程中扮演着多重角色，包括粘附宿主细胞、促进定殖、调节毒力因子表达和抗生素耐药性等。然而，OmpV在霍乱弧菌致病机制中的具体功能尚不清楚。这项发表在《Nature Communications》上的研究，不仅阐明了OmpV在霍乱弧菌致病过程中的关键作用，还通过计算机辅助药物设计发现了一种能够特异性靶向OmpV的小分子抑制剂C607-0736，为对抗多重耐药霍乱弧菌感染提供了新的治疗策略。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。研究采用了分子生物学技术包括qRT-PCR、电泳迁移率实验(EMSA)和染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR来分析基因表达和调控机制；通过蛋白质印迹(Western blot)和细胞热转移分析(CETSA)检测蛋白质表达和相互作用；利用计算机辅助药物设计(CADD)进行虚拟筛选和分子对接；通过体外细胞粘附实验和体内动物定殖实验评估抑制剂效果；使用透射电子显微镜(TEM)观察细菌胞外囊泡(BEVs)形态；并通过表面等离子共振(SPR)分析小分子与靶蛋白的结合亲和力。实验所用霍乱弧菌菌株为实验室保存菌株，动物实验使用CD-1乳鼠和C57BL/6小鼠模型。

CAMPs通过TCS CarSR促进ompV表达

研究人员首先发现，霍乱弧菌的CarSR双组分系统能够感知宿主肠道中的 cationic antimicrobial peptides (CAMPs)，并激活ompV的表达。基因组分析显示ompV和carSR在基因组上位置相邻。qRT-PCR结果表明，在ΔcarR菌株中ompV表达显著降低了5.20倍，而用HD-5(一种α-防御素)处理野生型(WT)菌株后，ompV表达上调了4.83倍。电泳迁移率实验和ChIP-qPCR进一步证实，磷酸化的CarR能够直接结合到ompV启动子区域的特定位点(CarR box)，从而正调控ompV的表达。

OmpV响应CAMPs增强致病性

通过免疫染色和qRT-PCR分析，研究人员证实霍乱弧菌感染能够诱导小鼠小肠中cathelicidin-related antimicrobial peptide (mCRAMP)的表达增加。更重要的是，ompV在小鼠小肠中的表达水平比在LB培养基中高5.57倍。小鼠定殖实验显示，ΔompV菌株的定殖能力显著低于WT菌株，而回补株(ΔompV+)的定殖能力得以恢复，表明OmpV能够促进霍乱弧菌在小肠中的定殖。

OmpV定位于外膜并促进细菌粘附

通过生物信息学预测和蛋白质印迹验证，研究人员发现OmpV同时存在于细菌外膜(OM)和细菌胞外囊泡(BEVs)中。细胞粘附实验表明，ΔompV菌株对Caco-2细胞的粘附能力显著降低。值得注意的是，OmpV并不影响霍乱毒素(CT)的表达水平，但能够促进CT向宿主细胞的递送。

BEVs中的OmpV促进CT向宿主细胞的递送

研究人员进一步探讨了BEVs在CT递送中的作用。结果显示，来源于ΔompV菌株的BEVs被Caco-2细胞内化的能力显著降低。尽管各菌株来源的BEVs中CT含量相当，但ΔompV来源的BEVs递送至宿主细胞的CT量减少，同时诱导的TNFα和IL-1β表达水平也降低。动物实验进一步证实，ΔompV来源的BEVs引起的小肠炎症和组织损伤程度较轻。

小分子化合物抑制OmpV介导的致病性

通过计算机辅助药物设计，研究人员从162万个化合物中筛选出能够靶向OmpV的小分子抑制剂。表面等离子共振分析显示，C607-0736与OmpV具有高亲和力(K_d=0.1227μM)。功能实验表明，C607-0736能够特异性抑制WT菌株的粘附能力和BEVs的内化，而对ΔompV菌株无影响。细胞热转移分析进一步在细胞水平证实了C607-0736与OmpV的直接结合。

C607-0736是广谱抑制病原性弧菌感染的抑制剂

动物实验表明，口服10 mg/kg的C607-0736能够显著抑制三种O1和三种O139血清型霍乱弧菌在小鼠小肠中的定殖，而对各ΔompV菌株的定殖无影响。此外，C607-0736对含有ompV的副溶血弧菌菌株G2871也有抑制作用。通过点突变实验，研究人员发现Asn28是C607-0736与OmpV结合的关键位点，该位点在霍乱弧菌O1/O139和副溶血弧菌的OmpV中高度保守。

本研究系统阐明了OmpV在霍乱弧菌致病机制中的关键作用：霍乱弧菌通过CarSR双组分系统感知肠道中的CAMPs，激活ompV表达；OmpV不仅促进细菌对肠上皮的粘附，还通过BEVs介导CT向宿主细胞的递送。研究人员通过计算机辅助药物设计发现的小分子抑制剂C607-0736，能够特异性靶向OmpV，有效抑制霍乱弧菌的粘附、定殖和毒素递送。值得注意的是，C607-0736对多种血清型的霍乱弧菌以及含有ompV的副溶血弧菌均表现出抑制作用，表明其具有广谱抗菌潜力。

这项研究的创新之处在于，不仅揭示了OmpV这一新的药物靶点，还成功开发了相应的靶向治疗策略。与传统抗生素不同，靶向毒力因子的治疗策略可能减少选择压力，延缓耐药性的产生。由于OmpV在多种病原体中保守存在，且其结构稳定性使得病原体难以通过基因突变产生耐药性，这为开发长效抗感染药物提供了新思路。该研究为应对日益严重的抗生素耐药性问题提供了有前景的解决方案，特别是对于多重耐药霍乱弧菌引起的感染具有重要的临床意义。