基于生物相容性锍盐的共价探针实现活细胞与固定细胞内源性微管蛋白的超分辨荧光成像

《Nature Communications》：Biocompatible sulfonium-based covalent probes for endogenous tubulin fluorescence nanoscopy in live and fixed cells

本研究针对传统荧光标记技术易干扰蛋白功能的问题，开发了基于锍盐连接子的共价荧光探针6-SiR-o-C9-CTX。该探针通过配体导向的磺酰化反应实现内源性微管蛋白的特异性共价标记，具备细胞膜通透性、荧光增强特性和生物相容性优势，成功应用于活细胞/固定细胞的STED纳米显微成像，为细胞动力学研究提供了重要工具。

　　

在细胞生物学研究领域，荧光显微镜技术犹如科学家们的"眼睛"，让我们能够直观观察生命活动的动态过程。尤其是突破衍射极限的超分辨显微镜技术，将观测精度提升至纳米级别，为解析细胞精细结构提供了强大工具。然而，这些先进成像技术的发挥很大程度上依赖于荧光标记的质量——如何在不干扰蛋白质正常功能的前提下实现精准标记，始终是领域内的核心挑战。

传统的标记策略主要存在两大瓶颈：一是荧光蛋白融合标记（如GFP）会引入分子量高达27 kDa的标签，相当于给目标蛋白"绑上重物"，极易导致蛋白错误定位和功能紊乱；二是基于配体非共价结合的荧光探针虽体积较小，但其配体可能占据蛋白活性位点，且需要持续存在于成像环境中，容易引发细胞毒性效应。特别是在研究微管蛋白这种细胞骨架关键组分时，这些问题尤为突出——微管不仅参与细胞分裂、运动等重要功能，其动态组装过程对外界干扰极为敏感。

面对这一挑战，德国马克斯·普朗克多学科科学研究所的研究团队在《Nature Communications》上发表了创新性研究成果。他们巧妙利用自然界中天然存在的锍盐代谢物为灵感，开发出一类基于生物相容性锍盐的共价荧光探针，成功实现了对内源性微管蛋白的高质量标记。这项工作的精妙之处在于将"配体导向化学"策略与"智能连接子"设计相结合：探针通过卡巴他赛（cabazitaxel）靶向微管蛋白，利用邻位苯甲基锍盐（ortho-benzyl sulfonium）作为可裂解连接桥，当探针结合到目标蛋白后，邻近的半胱氨酸残基会攻击锍盐中心，形成共价键的同时释放出配体部分。这种"标记后释放"的设计既确保了标记的特异性，又最大程度降低了对蛋白功能的干扰。

研究团队通过系统的探针优化，最终筛选出性能最优的6-SiR-o-C9-CTX探针。该探针采用硅罗丹明（SiR）为荧光团，具有独特的荧光开关特性：在游离状态下呈无荧光的螺内酯形式（OFF状态），易于穿透细胞膜；结合靶蛋白后转变为荧光开启的两性离子形式（ON状态），信噪比显著提升。更值得关注的是，这种共价标记具有持久性，允许研究人员在标记后洗脱掉具有细胞毒性的紫杉烷类配体，从而在维持高质量显微图像的同时，最大限度保持细胞的正常生理状态。

关键技术方法方面，研究团队通过7步合成路线构建了系列锍盐探针，采用体外微管蛋白标记实验结合质谱分析鉴定主要标记位点为β-微管蛋白Cys³⁵⁶，并利用人源细胞系（包括正常人真皮成纤维细胞和HeLa CCL、U-2 OS癌细胞系）进行活细胞成像验证，最终通过STED纳米显微镜实现微管结构的高分辨率成像。

■设计合成与光物理性质

研究人员设计了一系列以卡巴他赛为靶向配体、硅罗丹明为荧光团、不同区域异构的锍盐为连接桥的探针分子。通过收敛式合成路线，以20-43%的总收率成功制备了6种结构变体。光物理性质测试表明，所有探针在结合微管蛋白后均呈现4-14倍的荧光增强，其中邻位异构体（特别是探针2）表现最优，在蛋白结合状态下有49%的分子处于荧光开启状态，荧光增强达14.3倍。值得注意的是，探针在PBS缓冲液中主要以聚集态存在，而在表面活性剂SDS或微管蛋白环境中，螺环开环平衡向荧光态移动，这一特性确保了探针在细胞成像中的高信噪比。

■体外标记特性

体外实验显示，探针与猪脑微管蛋白的反应符合配体导向的邻近诱导反应机制，二级反应速率常数约为2-5 L·mol^-1·s^-1，与已报道的LDAI（配体导向酰基咪唑化学）效率相当。邻位异构体的反应速率较间位/对位快约50%，标记度（DOL）可达0.8-0.9。质谱分析鉴定出主要标记位点为β-微管蛋白Cys³⁵⁶，该位点位于紫杉醇结合口袋附近，与探针设计预期一致。标记产物在生理条件下稳定性良好，48小时内未观察到明显降解。

■活细胞标记验证

细胞实验表明，6-SiR-o-C9-CTX在三种人源细胞系中均实现良好的微管标记。Western blot分析证实探针特异性共价标记β-微管蛋白（55 kDa处明显条带），而非共价对照探针SiR-CTX则无此特性。洗涤实验进一步验证共价标记的稳定性：经2小时充分洗涤后，6-SiR-o-C9-CTX标记信号保持稳定，而SiR-CTX信号完全消失。更重要的是，洗脱配体后细胞的毒性显著降低（SubG1期细胞比例从40%降至对照水平），证明该方法可有效规避紫杉烷类药物的细胞周期干扰效应。

■超分辨成像应用

在成像性能方面，探针成功应用于STED纳米显微镜技术。在活细胞和戊二醛固定细胞中均可获得微管清晰图像，测得微管表观半高宽（FWHM）分别为49±13 nm（活细胞）和38±9 nm（固定细胞），分辨率较共聚焦显微镜提升8-9倍。此外，探针光稳定性支持长达500秒的时间序列成像，适用于动态过程观测。

这项研究通过巧妙的分子设计，将生物相容性锍盐化学与配体导向标记策略相结合，成功解决了内源性蛋白标记领域的长久难题。其创新性体现在三个方面：一是利用天然存在的锍盐衍生物作为连接桥，确保探针在细胞内的生物相容性；二是通过"标记-释放"机制实现功能解耦，在保持标记稳定性的同时消除配体副作用；三是优化的探针结构平衡了反应活性与稳定性，适用于活细胞长时程观测。

特别值得关注的是，该技术揭示的微管蛋白标记位点（β-tubulin Cys³⁵⁶）在不同物种间高度保守，预示着该方法具有广泛的适用前景。研究人员在讨论部分指出，这种基于锍盐的配体导向策略有望拓展至其他细胞内膜系统蛋白标记，为细胞动力学研究提供普适性工具平台。

从技术发展角度看，这项工作标志着内源性蛋白标记技术的重要突破。相比传统的基因编码标签或免疫荧光方法，这种化学标记策略不仅最大程度保持蛋白天然状态，还具备时间空间可控性优势。其与STED等超分辨技术的兼容性，为解析细胞骨架动态组装、囊泡运输等精细过程提供了新的观测窗口。

未来，随着探针库的进一步扩展和标记策略的优化，这种方法有望应用于更多关键蛋白靶点，推动细胞生物学研究向更高时空精度迈进。同时，其"标记后洗脱"的设计理念为高背景噪声环境下的特异性成像提供了新思路，对药物筛选、病理检测等应用领域也具有重要参考价值。