锥虫过氧化物酶体蛋白输入复合物的构象异质性及其调控机制的结构解析

《Nature Communications》：Structure of Trypanosoma peroxisomal import complex unveils conformational heterogeneity

本研究解析了克氏锥虫过氧化物酶体输入三元复合物（MDH-Pex5-Pex14NTD）的高分辨率冷冻电镜结构，首次揭示了Pex5受体与底物结合时存在的17°构象摆动现象。研究发现次级相互作用界面虽不显著影响结合亲和力，但通过限制构象异质性精细调控蛋白转运过程，为阐明完整折叠蛋白穿越生物膜的分子机制提供了关键结构基础。

　　

在真核细胞中，过氧化物酶体（peroxisome）是承担脂肪酸代谢、醚磷脂合成等重要功能的细胞器。由于缺乏蛋白质合成系统，所有酶蛋白都需通过过氧化物酶体靶向信号（PTS）系统从细胞质输入。其中最常见的PTS1信号会被胞质受体Pex5识别，形成复合物后停靠于由Pex14和Pex13组成的膜转运通道。然而，这个过程中折叠蛋白如何跨膜转运、受体-底物相互作用的动态调控机制等关键问题仍悬而未解。特别是在锥虫这类病原体中，过氧化物酶体特化为糖酵解体（glycosome），其输入系统已成为治疗查加斯病（Chagas disease）的重要药物靶点，但结构生物学研究的滞后严重制约了靶向药物开发。

近日《Nature Communications》发表的研究通过冷冻电镜技术解析了克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）中MDH-Pex5-Pex14_{NTD三元复合物的高分辨率结构，首次揭示了该系统中存在的构象异质性现象。研究发现Pex5受体在结合底物时表现出最大17°的摆动幅度，这种动态特性可能对蛋白转运过程具有重要调控作用。}

研究团队主要采用冷冻电镜单颗粒分析技术，结合三维变异性分析（3DVA）方法解析结构动态信息。通过等温滴定量热法（ITC）和荧光偏振（FP）实验定量测定蛋白互作亲和力，并利用位点定向突变验证界面功能。所有蛋白均在埃希氏大肠杆菌中表达纯化，锥虫基因序列通过人工合成获得。

Reconstitution of cargo-Pex5-Pex14_NTDternary complex

选择糖酵解体苹果酸脱氢酶（MDH）为模型底物，与全长Pex5及Pex14_NTD在体外成功重组三元复合物。尺寸排阻色谱显示新峰形成，SDS-PAGE证实三种组分共存。

Cryo-EM reconstructions and heterogeneity of the ternary complex

冷冻电镜揭示MDH以四聚体形式存在，但Pex5结合数量呈现动态变化（MP1-MP4）。通过3DVA分析发现Pex5的TPR结构域相对于MDH存在最大17°的倾角和13°的扭转角，这种构象异质性导致TPR结构域外围模体产生5-8 ?的位移。

Pex5-binding on MDH is characterized by conformational heterogeneity

PTS1信号肽嵌入Pex5的TPR结构域中央空腔，形成经典氢键网络。比较发现，结合状态下的TPR结构域相较于游离状态更为紧凑，这种构象变化在不同物种中具有保守性。

Secondary MDH-Pex5 interfaces do not significantly contribute to affinity

鉴定出两个非PTS1界面：界面1涉及MDH^62-70环（糖酵解体同工酶特有序列）与Pex5^439-444环；界面2涉及MDH^142-145与Pex5的α15螺旋。突变实验表明这些界面虽不显著影响结合亲和力（K_d变化<3倍），但通过限制构象异质性调控相互作用。

Transient interaction of Pex5^457-489loop with MDH

在远端构象中发现Pex5^457-489环与MDH亚基间沟槽的瞬时相互作用。该环在糖酵解体MDH特有的深沟槽（体积4900 ?³）中构象受限，缺失突变体（Δ470-480）反而增强亲和力，证实该相互作用通过空间位阻效应限制构象灵活性。

Pex14_NTDbinding site and Wxxx(F/Y) independent interactions with Pex5

解析出Pex14_NTD与Pex5的延伸结合界面：经典Wxxx(F/Y) motif（WVREY）占据疏水沟槽，新发现的非Wxxx(F/Y)界面（353-NNPYM-358）贡献60%埋藏面积。这种"邻近组装"（proximity assembly）界面缺乏典型相互作用特征，突变验证其对各界面贡献的亲和力影响有限（K_d变化<3.5倍）。

研究结论表明，Pex14_NTD结合不仅不会引发底物释放，反而使Pex5对PTS1的亲和力提高3.2倍。这颠覆了传统认为Pex14结合触发底物释放的观点，支持了近期提出的通过Pex2/10/12泛素连接酶复合物实现受体循环的新模型。同时，Pex5的N端结构域在复合物中始终处于非结构化状态，提示其可能在膜转运过程中发挥柔性连接作用。

该研究首次在原子水平揭示过氧化物酶体输入机器的动态组装机制，阐明了次级相互作用通过调控构象异质性而非亲和力来精细调控转运过程的新原理。这不仅为理解完整折叠蛋白跨膜转运这一基本生物学问题提供新范式，也为开发针对锥虫糖酵解体输入系统的特异性药物奠定了结构基础。研究中建立的构象异质性分析方法体系，为研究其他动态生物大分子复合物提供了重要技术参考。