ATP依赖性DNA损伤识别机制的结构快照：UvrA通过构象变化机械探测DNA完整性

《Nature Communications》：Structural snapshots of the mechanism of ATP-dependent DNA damage recognition by UvrA

本研究针对细菌核苷酸切除修复(NER)中UvrA蛋白的ATP酶活性在DNA损伤识别中的具体机制这一关键科学问题，通过解析UvrA与三种不同DNA在有无核苷酸存在条件下的冷冻电镜结构，揭示了ATP结合诱导UvrA二聚体发生重大重排，形成"楔形"结构插入DNA双螺旋中心以探测DNA稳定性，提出了机械探测DNA变形能力的损伤识别新机制，为理解细菌NER广谱识别多种DNA损伤的分子基础提供了重要结构见解。

　　

在生命活动中，DNA无时无刻不面临着各种内外源性损伤的威胁，从紫外线引起的嘧啶二聚体到化学物质导致的碱基修饰。为了维持遗传信息的完整性，生物体演化出了多种DNA修复途径，其中核苷酸切除修复(Nucleotide Excision Repair, NER)因其能够识别和修复多种结构不相关的DNA损伤而显得尤为重要。在细菌中，这一修复过程由UvrA、UvrB和UvrC三种核心蛋白协同完成。UvrA作为损伤识别蛋白，负责扫描DNA并初步定位损伤位点，然后将损伤DNA传递给UvrB进行验证，最终由UvrC执行切割操作。

尽管科学家们对细菌NER途径已有数十年研究，但UvrA蛋白如何利用其ATP酶活性来识别DNA损伤的具体分子机制仍不清楚。UvrA属于ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)ATP酶家族，形成二聚体结构，含有两个ATP酶模块。早期研究表明，ATP酶活性对于UvrA识别紫外线诱导的损伤至关重要，但这一活性在损伤识别中的具体作用机制仍是未解之谜。

为了解决这一科学问题，来自波兰华沙国际分子与细胞生物学研究所的Marcin Nowotny团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们通过冷冻电镜技术解析了UvrA与不同DNA复合物在不同核苷酸状态下的高分辨率结构，首次捕捉到了ATP结合诱导的UvrA二聚体构象变化的"结构快照"，揭示了UvrA通过机械探测DNA变形能力来识别损伤的新机制。

研究人员主要运用了冷冻电子显微镜单颗粒分析技术解析蛋白质结构，采用凝胶过滤色谱和镍柱亲和色谱进行蛋白质纯化，利用2-氨基嘌呤荧光光谱法监测碱基翻转现象，并通过pull-down实验分析蛋白质-DNA相互作用。研究使用了来自热纤梭菌的UvrA、UvrB和UvrC蛋白，以及三种50bp的双链DNA底物：含有单个荧光素修饰胸腺嘧啶的DNA、含有脱碱基位点的DNA和未修饰DNA。

UvrA:DNA结构在无核苷酸或ADP存在时的特征

研究人员首先解析了Ct-UvrA与flu-dT-DNA在无核苷酸条件下的冷冻电镜结构，分辨率达3.1?。该结构显示UvrA二聚体呈现"基础构象"，DNA以直线形式结合于蛋白质中，未发生明显弯曲。类似的构象也在UvrA与脱碱基DNA复合物及ADP存在下的flu-dT-DNA复合物中被观察到，表明在无ATP或ADP存在时，UvrA采用相似的构象与DNA结合。

与此前解析的Tm-UvrA与flu-dT(2)-DNA晶体结构相比，本研究中的冷冻电镜结构显示DNA轨迹是直的，而在晶体结构中DNA是弯曲的。另一个明显区别是DNA结合域的位置：在Tm-UvrA结构中，这些结构域远离DNA且不与之相互作用，而在Ct-UvrA结构中则与DNA有相互作用。这表明DNA结合域仅在DNA呈直线构象时与之相互作用。

AMPPNP存在下UvrA与DNA复合物的结构

为捕捉ATP结合状态，研究人员解析了Ct-UvrA与flu-dT-DNA在AMPPNP存在下的结构，分辨率达3.10?。与基础构象相比，AMPPNP结合诱导了UvrA二聚体的显著重排，形成了"ATP结合构象1"。这一构象变化包括签名结构域向ATP结合结构域移动，导致二聚体界面重组，并在签名结构域I和ATP结合结构域I之间形成裂隙，容纳了来自二聚体亚基的特征性β-发夹元件。

这一构象变化导致DNA发生约20°的弯曲，并可能伴随拉伸和解旋。值得注意的是，在这种构象下，研究人员观察到一个由Y62、Q65和F66等残基形成的"楔形"结构插入DNA双螺旋中心，与核碱基形成范德华力和堆积相互作用，可能导致中心碱基的翻转。

对于未修饰DNA，研究人员发现了两种ATP结合构象：构象1和构象2。两种构象中DNA均发生弯曲，但二聚体界面排列不同。在ATP结合构象2中，楔形结构插入DNA更深，形成了额外的相互作用。这种构象多样性可能有助于UvrA识别不同类型的DNA损伤。

ATP酶活性位点的配置与协调机制

通过分析不同结构中的ATP酶活性位点，研究人员发现，在ATP结合构象1和2中，所有四个活性位点均处于催化活性的"闭合"配置；而在无核苷酸或ADP存在时，活性位点呈现"开放"配置。有趣的是，在无DNA情况下，即使有AMPPNP存在，UvrA也保持基础构象，活性位点为开放配置，但远端位点能结合AMPPNP。这表明DNA结合和两个活性位点的核苷酸占据共同促进UvrA形成ATP结合构象。

研究人员还发现，DNA结合通过稳定Q环的构象来促进ATP酶活性。Q环中的保守谷氨酰胺残基与ATP的γ磷酸相互作用，在DNA弯曲时，其构象被稳定，从而有助于两个活性位点结合ATP。

UvrA:UvrB:DNA复合物的结构特征

研究人员进一步解析了Ct-UvrA:UvrB:flu-dT-DNA:AMPPNP复合物的结构，分辨率达2.97?。该结构显示UvrA二聚体采用ATP结合构象1，两个UvrB分子位于UvrA二聚体两侧，通过β-发夹钳制DNA链。这一观察结果与之前提出的UvrB加载模型一致，即UvrB通过其β-发夹元件钳制DNA链，为后续的损伤验证和切除做准备。

Pull-down实验表明，仅在AMPPNP或ATP存在时，UvrB能有效加载到DNA上，且这一过程依赖于UvrA的楔形结构。在ATP存在时，flu-dT DNA的pull-down效率高于未修饰DNA，表明系统对修饰DNA具有特异性。而在AMPPNP存在时，修饰和未修饰DNA的UvrB加载效率相当，这与非水解ATP类似物减弱UvrA对损伤DNA特异性的先前发现一致。

研究结论与意义

本研究通过系列冷冻电镜结构揭示了一个全新的UvrA介导的DNA损伤识别机制。研究人员提出，UvrA利用ATP结合和水解循环在两种主要构象状态之间转换：基础构象和ATP结合构象。在ATP结合构象中，UvrA二聚体发生重排，导致DNA弯曲，并形成楔形结构插入DNA双螺旋中心，直接探测DNA的稳定性和碱基配对强度。

这一机制解释了细菌NER如何能够检测多种化学性质不相关的DNA损伤。对于严重扭曲DNA的损伤，预存在的变形可直接被基础构象的UvrA识别；而对于变形较小的损伤，则通过ATP水解驱动的构象变化进行机械探测来间接识别。

研究还表明，UvrA:UvrB复合物可在不同UvrA二聚体构象下形成，包括基础构象和ATP结合构象，说明ATP依赖和非依赖的损伤识别模式均可在UvrA:UvrB复合物背景下发挥作用。

这些发现不仅深化了我们对细菌DNA损伤识别机制的理解，也为开发针对细菌NER途径的抗菌策略提供了理论基础。通过揭示UvrA如何利用ATP酶活性进行DNA损伤识别，本研究为理解ABC ATP酶超家族中其他成员的机制提供了重要参考。

该研究的结构数据为后续研究提供了坚实基础，包括时间分辨冷冻电镜、单分子生物物理学和分子动力学模拟等，将共同构成细菌NER损伤识别的全面图景。随着这些研究的深入，我们对生命如何维持基因组完整性的理解将不断深化，为相关疾病的治疗和新药的开发开辟新的可能性。