H3K36甲基化：表观基因组完整性的守护者

《Nature Communications》：H3K36 Methylation as a Guardian of Epigenome Integrity

本研究针对H3K36甲基化在维持表观基因组稳定性中的核心作用机制不明确的问题，通过构建组合性敲除五种H3K36甲基转移酶（K36MTs）的小鼠间充质干细胞模型，并结合HNSCC细胞中H3K36M癌组蛋白过表达系统，揭示了H3K36me2通过维持增强子活性、拮抗PRC2介导的H3K27me3沉积、阻止SUV39H1介导的H3K9me3异常分布，从而守护三维基因组结构完整性的新机制，为理解发育异常和肿瘤发生提供了新视角。

　　

在我们的细胞核内，DNA并非裸露存在，而是与组蛋白紧密缠绕形成染色质。染色质的结构和功能状态，如同一套复杂的密码，决定了基因的开启与关闭，进而调控着生命的进程。这套密码系统主要由组蛋白修饰构成，其中H3K36甲基化（H3K36me）是一个关键成员。它如同一个活跃的标记，广泛存在于转录活跃的基因区域，与基因的激活密切相关。当编码H3K36甲基转移酶（K36MTs）的基因或组蛋白H3本身发生突变时，会导致严重的发育障碍或癌症。然而，尽管其重要性日益凸显，H3K36me如何精确地维护表观基因组稳定性，其具体机制仍笼罩在迷雾之中。例如，它如何与其他重要的组蛋白修饰，如抑制性的H3K27me3和H3K9me3相互作用？它的缺失又会如何撼动整个基因组的三维结构？这些都是悬而未决的关键科学问题。

为了深入解答这些问题，来自麦吉尔大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项重要研究。他们巧妙地利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建了一套系统性的小鼠间充质干细胞（mMSC）模型。这些细胞模型如同精密的工具，能够逐步“剥离”H3K36me标记：从单基因敲除（如SETD2、NSD1、NSD2、NSD3、ASH1L），到双敲除（NSD1/2-DKO）、三敲除（NSD1/2-SETD2-TKO）、四敲除（NSD1/2/3-SETD2-QKO），直至最终的五重敲除（NSD1/2/3-SETD2-ASH1L-QuiKO）细胞，后者几乎完全缺失H3K36me2和H3K36me3。同时，为了验证发现的普适性，他们还在人头颈鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系（Cal27和Detroit562）中过表达了H3K36M癌组蛋白，该突变能全局性降低H3K36甲基化水平。通过这些精巧设计的模型，研究人员得以像拆解精密钟表一样，逐层剖析H3K36me在不同层面的功能。

研究人员综合运用了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）、RNA测序（RNA-seq）、切割标签测序（CUT&RUN）、全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）、高通量染色体构象捕获技术（Hi-C）、免疫荧光（IF）、定量质谱（MS）以及生物信息学分析等多种前沿技术，对野生型和各种H3K36me缺陷型细胞的表观遗传景观、转录组和三维基因组结构进行了全面而深入的刻画。

NSD3介导的H3K36me2维持增强子活性

研究人员首先聚焦于由NSD3负责沉积在活性顺式调控元件（CREs）上的局灶性H3K36me2。他们发现，当NSD3被敲除导致这些区域的H3K36me2缺失后，增强子（而非启动子）表现出更明显的染色质可及性下降、激活型标记（如H3K27ac、H3K4me1/3）减少，以及抑制性标记H3K27me3的侵入。更重要的是，那些依赖H3K36me2标记增强子调控的基因，其表达水平显著下调。这表明，NSD3介导的H3K36me2对于维持增强子的活性状态至关重要，其缺失会通过削弱增强子功能进而影响靶基因的表达。

ASH1L介导的H3K36me2调控特定基因表达

在几乎完全缺失H3K36me2/3的四敲除（QKO）细胞中，研究人员发现仍有119个由ASH1L维持的H3K36me2峰残留。当进一步敲除ASH1L（QuiKO细胞）后，这些峰消失，并导致其靶基因的表达下调，且下调程度与原有H3K36me2峰的大小成正比。同时，这些位点的H3K27ac水平进一步下降，而H3K27me3水平上升。有趣的是，在仅敲除ASH1L而其他K36MTs完好的细胞中，由于其他酶的功能补偿，这些位点的H3K36me2水平和靶基因表达均未发生显著变化。这提示，是H3K36me2本身的缺失，而非ASH1L蛋白的非催化功能，主导了所观察到的基因表达抑制。

H3K36甲基化拮抗基因体内的H3K27甲基化

已知H3K36me3能通过变构抑制PRC2复合物的活性，阻止其沉积抑制性标记H3K27me3，从而将后者排除在活跃转录的基因之外。本研究进一步细化了这一拮抗关系。研究发现，单独缺失H3K36me3（SETD2-KO）对基因体内H3K27me3侵入的影响有限，但会导致H3K27me2在基因体内的沉积增加，并伴随H3K27me1的减少。而当H3K36me2也发生缺失时（NSD1/2-DKO 或 TKO），H3K27me2和H3K27me3则会大规模侵入基因体，且这种侵入对基因的转录活性依赖减弱。然而，即使在完全缺失H3K36me的QuiKO细胞中，H3K27me3也未能完全占据高表达基因的基因体，提示转录过程中的组蛋白周转或DNA甲基化（DNAme）可能构成了额外的保护屏障。与此一致的是，研究发现即使H3K36me完全缺失，高表达基因体内的DNAme水平仍能维持，表明DNMT1介导的维持性甲基化足以补偿由于缺乏H3K36me介导的DNMT3A/B招募而可能造成的缺失。

H3K36甲基化影响其他表观遗传修饰

研究还发现，H3K36me的缺失会导致基因体内H3K4me1水平的升高，这可能与KMT2C/D表达的改变有关。更重要的是，研究揭示了一个此前未被充分认识的、H3K36me与H3K9me3之间的拮抗关系。随着H3K36me的逐步缺失，原本被排除在转录活跃基因之外的H3K9me3开始侵入基因体，且侵入程度与H3K36me的残留量负相关。定量质谱分析显示，SETD2-KO和TKO细胞中全局H3K9me3水平有所增加，但在QKO和QuiKO细胞中又恢复至接近野生型水平，暗示H3K9me3在基因组内发生了重新分布。

H3K36me缺失导致SUV39H1介导的H3K9me3重新分布

上述发现引出了下一个关键问题：H3K9me3是如何重新分布的？通过全基因组聚类分析，研究人员将基因组区域分为两类：在H3K36me缺失条件下获得H3K9me3的A类区域（主要是常染色质、基因丰富区）和丢失H3K9me3的B类区域（主要是异染色质、基因荒漠区）。研究发现，主要的H3K9me3甲基转移酶SUV39H1在H3K36me缺失的细胞中，从其原本富集的B类区域（大范围异染色质域）重新定位到了A类区域（常染色质），并在这些区域异常地沉积了H3K9me3。通过敲低（KD）或过表达（OE）SUV39H1的实验，研究人员证实了SUV39H1的这种重新分布是导致观察到的H3K9me3在常染色质区域异常积累和在异染色质区域丢失的主要原因。

H3K9me3缺失引发下游表观遗传级联反应

B类区域（异染色质）H3K9me3的丢失引发了一系列深远后果。首先，异染色质蛋白1（HP1）的结合随之丢失。其次，尽管有补偿性的H3K27me3在这些区域的积累，但不足以维持完全的转录沉默。相反，许多B类区域出现了染色质可及性增加、激活型标记（如H3K27ac, H3K4me1）的富集以及转录活性升高，表明部分异染色质区域被激活。同时，一些内源性逆转录酶元件（TEs）的转录也被激活。在A类区域（常染色质），由于SUV39H1的侵入和H3K9me3的异常沉积，导致了HP1的招募和局部基因沉默。

H3K36甲基化缺失导致3D基因组结构破坏

三维基因组结构的分析（Hi-C）显示，H3K36me的缺失导致了染色体区室化的显著破坏。在野生型细胞中清晰可见的活跃（A）区室和惰性（B）区室之间的相互作用模式变得模糊，特别是B-B区室间的长程相互作用大幅减弱。同时，染色质环（特别是长距离环）的数量也显著减少。这些结构变化在显微镜下也得到了印证：免疫荧光显示，在H3K36me缺陷的细胞中，原本位于核周边的致密H3K9me3信号灶变得弥散，并向核内部分布。这些结果共同表明，H3K36me对于维持更高级别的染色质三维结构和核内空间组织至关重要。

研究结论与意义

综上所述，这项研究系统性地阐明了H3K36甲基化作为表观基因组完整性“守护者”的多重功能。它不仅通过维持增强子活性和拮抗PRC2来保护常染色质状态，更重要的是，它通过限制SUV39H1的异常活动，防止了异染色质标记H3K9me3对常染色质的“入侵”，同时也有助于维持大范围异染色质域（B类区域）的稳定性。H3K36me的缺失会打破这种平衡，导致SUV39H1重新分布、H3K9me3在基因组的异常沉积与丢失、异染色质崩溃、常染色质抑制，并最终引起三维基因组结构的全面重构和基因表达的广泛失调。该研究在多种细胞模型（小鼠MSC和人HNSCC细胞）中的一致性发现，凸显了H3K36me这一功能的保守性和重要性，为理解相关发育疾病和癌症（如富含H3K36突变或NSD1突变的头颈癌）的表观遗传失调机制提供了全新的框架，并指出H3K36me-SUV39H1轴可能是一个潜在的治疗干预节点。