永久冻土融化梯度下ssDNA与dsDNA病毒种群生态学及生物地球化学意义研究

《Nature Communications》：Population ecology and biogeochemical implications of ssDNA and dsDNA viruses along a permafrost thaw gradient

随着气候变化加速永久冻土融化，封存碳库的微生物降解风险加剧，但病毒在其中的作用尚不明确。本研究针对瑞典Stordalen Mire的永久冻土融化梯度，通过病毒颗粒富集和宏基因组学方法，鉴定出9,963个病毒种群（vOTUs），发现其携带大量碳循环相关辅助代谢基因（AMGs），揭示了病毒通过调控微生物代谢影响温室气体排放的新机制，为预测冻土碳循环提供了新视角。

　　

北极永久冻土区储存着全球约50%的土壤碳，但随着气候变暖，这些"沉睡的碳库"正以每年约1厘米的速度融化。冻土融化后，原本被冻结的有机质会被微生物分解，可能释放大量二氧化碳和甲烷等温室气体，进一步加剧气候变化。虽然微生物在冻土碳循环中的作用已得到较多研究，但病毒作为微生物世界的重要调控者，它们在冻土融化过程中的角色却一直是个谜。

病毒是地球上数量最丰富的生物实体，在海洋生态系统中，病毒每天裂解约三分之一的微生物，显著影响全球碳循环。此外，病毒还能通过携带的辅助代谢基因（AMG）重新编程宿主细胞的代谢活动。然而，由于土壤环境的复杂性和技术挑战，我们对土壤病毒，特别是永久冻土区病毒的了解还非常有限。

为了解决这一知识空白，由美国俄亥俄州立大学的Gareth Trubl、Virginia I. Rich和Matthew B. Sullivan领导的研究团队，在瑞典北部的Stordalen Mire进行了深入研究。该地区是一个典型的泥炭地，拥有从完整冻土（palsa）、部分融化（bog）到完全融化（fen）的自然融化梯度，是研究气候变化对生态系统影响的天然实验室。研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员在2016年和2017年的7月采集了20个土壤样本，覆盖不同的融化阶段和深度（1-34厘米）。他们采用优化的病毒颗粒富集方法，使用柠檬酸钾缓冲液和镁硫酸盐从泥炭样品中重新悬浮病毒，然后通过过滤和DNA提取获得病毒DNA。为了全面捕获病毒多样性，研究团队比较了两种建库方法：Nextera XT试剂盒（主要捕获dsDNA病毒）和Accel-NGS 1S plus试剂盒（可同时捕获ssDNA和dsDNA病毒）。最终获得40个病毒宏基因组文库，通过Illumina HiSeq平台进行测序。

研究人员开发了优化的生物信息学流程，包括读长去重复和组装算法改进，显著提高了病毒操作分类单元（vOTU）的回收率。他们使用VirSorter2和geNomad鉴定病毒contig，通过95%平均核苷酸同一性（ANI）和85%比对比例（AF）对病毒contig进行聚类，获得非冗余的vOTUs。病毒基因组质量通过CheckV评估，宿主预测结合了CRISPR spacer匹配、序列相似性比对和iPHoP工具。辅助代谢基因通过DRAM-v进行鉴定和功能注释。

病毒种群的特征与生态学

研究共鉴定出9,963个病毒种群，包括9,233个dsDNA vOTUs和730个ssDNA vOTUs，其中99.9%相对于其他土壤环境都是新颖的。CheckV评估显示有24个完整的dsDNA病毒基因组、552个高质量基因组，以及676个完整的ssDNA病毒基因组。Beta多样性分析显示病毒群落结构具有明显的生境特异性，主要受栖息地类型而非深度或年份的影响。随着冻土融化程度的增加，病毒的多样性和相对丰度也增加，bog阶段的病毒丰富度最高。共有6,824个vOTUs（69%）为特定生境独有，只有203个（2%）存在于所有三个生境中。

ssDNA病毒的多样性与分布

730个ssDNA vOTUs主要属于Cressdnaviricota（73%）、Phixviricota（18%）、Cossaviricota（5%）和Hofneiviricota（4%）四个门。在科一级分类水平上，Microviridae（31%）、Circoviridae（17%）和Parvoviridae（18%）是相对丰度最高的家族。ssDNA病毒在fen样本中相对丰度最高（74%），其次是bog（19%）和palsa（7%）。不同分类群的分布模式各异，如Cressdnaviricota在fen中显著富集，而Microviridae在palsa和fen中丰度较高。

vOTUs的全球比较

与海洋、人类肠道和其他土壤环境的病毒数据集相比，Stordalen Mire的vOTUs显示出极高的生境特异性，99.8%的vOTUs为生物群落特异性，只有一个vOTU在三种环境中共享。与其他土壤数据集比较时，96%的vOTUs是新奇的，只有4%与之前的Stordalen Mire数据集重叠。与另一个泥炭地（Les Pradeaux Mire）的ssDNA病毒比较也显示重叠有限，表明土壤中ssDNA病毒的序列空间仍有大量未知多样性。

推断土壤病毒的生态系统影响

通过多种方法预测了病毒宿主：CRISPR spacer匹配将13个dsDNA vOTUs与24个MAGs连接；序列相似性分析为488个vOTUs预测了644个新宿主；iPHoP工具为3,806个vOTUs（38%）预测了宿主，涵盖41个细菌和古菌门。重要的病毒-宿主连接包括：124个vOTUs与产甲烷古菌相连，涉及三个古菌门；243个vOTUs与16个甲烷氧化菌相连；231个vOTUs与非产甲烷的甲基营养菌相连。这些发现表明病毒可能影响冻土生态系统的甲烷循环。

病毒携带的辅助代谢基因（AMGs）

研究鉴定出811个推定的AMGs，来自658个vOTUs。按功能分类，48%与碳利用相关，2%与有机氮代谢相关，45%为其他功能，3.5%与能量代谢相关，1%与转运蛋白相关。随着冻土融化，AMGs的检测数量和功能多样性增加（palsa 29%，bog 31%，fen 40%）。碳循环相关的AMGs涉及多糖降解（如糖苷水解酶GH）、单糖降解、短链脂肪酸和C1化合物互变。特别值得注意的是，发现了6个vOTUs携带天冬氨酸消旋酶（racD），该酶可能通过促进D-氨基酸的形成来稳定微生物残体，从而影响长期碳储存。

本研究系统揭示了永久冻土融化梯度下病毒的多样性和生态功能，发现病毒群落具有明显的生境特异性，且随着冻土融化，病毒多样性、病毒-宿主关联和AMGs的功能多样性均增加。病毒通过感染关键碳循环微生物和携带多种辅助代谢基因，可能显著影响微生物碳降解途径的多个阶段，从复杂多糖降解到甲烷生成。特别是病毒携带的碳循环相关基因，表明它们在冻土碳循环中扮演着此前未被重视的重要角色。这些发现强调了将病毒过程整合到生态系统生物地球化学模型中的必要性，对于理解和预测气候变化背景下冻土碳循环具有重要意义。