脂质氧自由基防御通路（LORD）的发现及其表观遗传调控机制

《Nature Communications》：Identification of a lipid oxygen radical defense pathway and its epigenetic control

本研究针对细胞膜磷脂易受氧化损伤、脂质过氧化调控机制不明的科学问题，系统揭示了由ZNF354A/KAP1/SETDB1/ATF2复合物介导的脂质氧自由基防御通路（LORD）。研究人员通过多组学分析、基因编辑及功能验证，发现脂质过氧化物积累可触发p38/JNK依赖的ATF2/KAP1/ZNF354A磷酸化级联反应，促使抑制复合物解离并激活NRF2等抗氧化基因网络，从而调控GPX4酰化修饰及GSH稳态，显著影响细胞铁死亡敏感性。该通路为氧化应激相关疾病（如癌症、神经退行性疾病）提供了新的治疗靶点。

　　

在生命活动过程中，细胞不可避免地会产生活性氧（ROS）。这些分子如同双刃剑：一方面参与重要的信号传导，另一方面，过量的ROS会导致氧化应激，对DNA、蛋白质和脂质等生物分子造成损伤。细胞膜上的磷脂，特别是那些富含多不饱和脂肪酸（PUFA）的磷脂，极易受到自由基攻击，发生脂质过氧化。这种损伤的积累是铁死亡（ferroptosis）的标志之一。铁死亡是一种铁依赖性的、非凋亡形式的细胞死亡，与衰老、癌症、神经退行性疾病、慢性炎症等多种生理病理过程密切相关。

为了维持细胞内环境的稳定，细胞进化出了复杂的抗氧化防御系统，例如经典的谷胱甘肽（GSH）/GPX4通路和FSP1/CoQ₁₀系统。然而，在哺乳动物等复杂生物体中，这些脂质质量控制和损伤修复机制在转录水平上是如何被精确调控的，尤其是是否存在一个核心的调控枢纽，仍然是领域内一个悬而未决的关键科学问题。

为了解决这一难题，由Francisco S. Mesquita和F. Gisou van der Goot共同领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项重磅研究，他们发现并阐明了一条全新的防御通路——脂质氧自由基防御（Lipid Oxygen Radical Defense, LORD）通路。这条通路的核心在于一个前所未有的表观遗传调控机制。

研究人员在探索SARS-CoV-2病毒感染如何诱导酰基转移酶ZDHHC20产生更长转录本（ZDHHC20L）的过程中，意外地发现ZDHHC20L的表达实际上是一个更广泛的应激反应路径的“哨兵”。他们顺藤摸瓜，鉴定出一个由KRAB锌指蛋白ZNF354A、支架蛋白KAP1/TRIM28（KAP1）、组蛋白甲基转移酶SETDB1以及转录激活因子ATF2组成的抑制性复合物。在正常状态下，这个复合物结合在ZDHHC20等靶基因的特定DNA区域，通过SETDB1催化的组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化（H3K9me3）修饰，抑制这些基因的表达，从而将细胞的抗氧化防御水平维持在一个较低的基础状态。

当细胞遭遇应激（如病毒感染、毒素处理、过氧化氢刺激或衰老），导致脂质过氧化物积累时，细胞内的p38和JNK激酶被激活。它们会磷酸化ATF2、KAP1（Ser-473位点）和ZNF354A（Ser-169位点）。这一系列磷酸化事件如同解开了复合物的“锁”，导致ZNF354A从DNA上脱离，抑制性复合物解体。随后，被解除抑制的基因得以表达，其中包括NRF2通路的多个关键靶基因，它们共同构成了一个强大的抗氧化防御网络，保护细胞免受脂质过氧化损伤和铁死亡。

研究团队还揭示了该通路的一个关键效应机制：ZDHHC20L能够更有效地催化GPX4的S-酰化修饰，从而增强GPX4的活性。这意味着LORD通路不仅从转录水平上激活抗氧化基因，还能从翻译后修饰水平直接增强核心解毒酶GPX4的功能，形成双重保险。

为了阐明LORD通路的组成、调控机制及其生物学功能，研究人员综合运用了多种关键技术。这些方法包括利用ENCODE公共数据库和KRABopedia资源进行生物信息学挖掘，以预测转录因子和表观调控蛋白的结合位点；通过染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）和RNA测序（RNA-seq）在全基因组范围内描绘ZNF354A的DNA结合图谱及其敲低后的转录组变化；采用基因沉默（siRNA）、基因敲除（CRISPR-Cas9）和过表达技术，在多种人源和鼠源细胞系（如U2OS, HAP1, HEK293T, Calu-3等）中功能验证各个通路组分的作用；利用蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）和磷酸化特异性抗体（如针对p-ATF2 Thr-69, p-KAP1 Ser-473）分析蛋白质间的相互作用及其磷酸化动态；通过流式细胞术结合C11-BODIPY和LiperFluo荧光探针检测脂质过氧化水平，并使用细胞活力检测（ATP assay）评估铁死亡敏感性；以及采用³H-棕榈酸标记和点击化学（Click Acyl-PEG assay）等技术验证GPX4的S-酰化修饰。研究还涉及了对人原代气道上皮细胞、小鼠结肠炎模型等临床前样本的分析。

ZDHHC20L作为应激反应通路读数的发现

研究人员最初观察到ZDHHC20L在多种应激条件下被诱导表达，包括SARS-CoV-2感染、气溶素毒素处理、化学诱导的小鼠结肠炎以及老年人来源的原代肺上皮细胞。这表明ZDHHC20L的表达是一个保守的应激反应标志，引导他们去探寻其上游调控通路。

转录因子ATF2激活触发ZDHHC20L表达

通过分析ENCODE数据，研究人员发现ATF2结合在ZDHHC20基因上游调控区域。功能实验证实，沉默ATF2或阻止其磷酸化（如ATF2-6A突变体）会抑制应激诱导的ZDHHC20L表达，而模拟持续磷酸化的ATF2-6D突变体则足以在无应激条件下诱导ZDHHC20L表达。ATF2的激活还对气溶素诱导的细胞死亡具有保护作用。

ZDHHC20L受异染色质诱导复合物抑制

生物信息学分析显示，在ZDHHC20基因座附近存在KAP1和SETDB1的结合位点以及H3K9me3抑制性组蛋白标记。功能上，敲低SETDB1或KAP1，或者使用催化失活的SETDB1突变体，都能导致ZDHHC20L的表达，证明KAP1/SETDB1复合物在基础状态下抑制ZDHHC20L的表达。

ZNF354A将抑制复合物招募至ZDHHC20L调控区

通过筛选KRAB锌指蛋白（KZFP）库，研究人员发现ZNF354A的结合位点与ZDHHC20基因座的抑制区域高度重合。只有敲低ZNF354A（而非其同源蛋白ZNF354B或其他KZFPs）能特异性诱导ZDHHC20L表达。免疫共沉淀实验证明ZNF354A与KAP1和ATF2存在于同一复合物中，且气溶素处理会破坏ZNF354A与KAP1的相互作用。

KAP1-ZNF354A抑制复合物的动态调控

研究发现，应激信号（如气溶素、H₂O₂）会诱导KAP1（Ser-473）和ZNF354A发生磷酸化。ATF2的磷酸化是这一过程的先导事件，因为表达ATF2-6D足以驱动KAP1和ZNF354A的磷酸化以及复合物的解离。p38和JNK激酶的抑制剂能够阻断这些磷酸化事件和ZDHHC20L的表达。

ZNF354A决定氧化应激反应基因特异性

通过分析ZNF354A的ChIP-seq数据及其敲低后的RNA-seq数据，研究人员发现ZNF354A靶向调控大量与抗氧化防御、硒代谢、谷胱甘肽合成、铁代谢等相关的基因（如MAT1A, SLC7A11, TXNRD1, FSP1等）。基因集富集分析（GSEA）显示，ZNF354A敲低后上调的基因显著富集在NRF2通路、对化学应激的反应等条目。

ZDHHC20L表达由脂质过氧化诱导

实验证明，直接使用H_{2O2或通过抑制GPX4（RSL3）、抑制胱氨酸摄取（Erastin）来诱导脂质过氧化，均能触发ZDHHC20L的表达以及ATF2/KAP1/ZNF354A的磷酸化。而脂质过氧化抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）则能有效阻断这些事件。}

应激诱导ZNF354A从调控位点释放

关键的ChIP-seq实验发现，H₂O₂处理会导致ZNF354A从其结合的绝大多数基因组位点上解离，包括ZDHHC20、MAT1A等关键靶基因的调控区域，从而解除抑制，允许基因表达。

ZNF354A作为铁死亡敏感性的调控因子

功能上，敲低ZNF354A能降低细胞基础脂质过氧化水平，增强细胞对RSL3、H₂O₂和Erastin诱导的铁死亡的抵抗力。相反，过表达ZNF354A则会增加脂质过氧化并导致铁死亡样细胞死亡，该死亡可被Fer-1或NAC挽救。有趣的是，FSP1的过表达能有效挽救ZNF354A过表达引起的细胞死亡，而GPX4则不能，除非同时补充NAC以增加GSH水平，提示ZNF354A通过调控GSH稳态影响GPX4功能。此外，在一些组成性表达ZDHHC20L的癌细胞系（如HEPG2, MCF7）中，也检测到ZNF354A的磷酸化，并且这些细胞对铁死亡诱导剂表现出更强的抵抗力。

ZDHHC20L是LORD通路的功能效应器

最后，研究证实ZDHHC20L是该通路的一个重要功能输出。他们发现ZDHHC20（尤其是长异构体ZDHHC20L）能够催化GPX4的S-酰化修饰，且氧化应激（H₂O₂）能显著增强这一修饰。敲低ZDHHC20会升高细胞内GSH水平并损害细胞活力，而重新表达ZDHHC20L能有效恢复活力并增强细胞对H₂O₂的抵抗能力，其效果优于短异构体。

这项研究最终描绘出LORD通路的完整画卷：在稳态下，ATF2-KAP1-SETDB1-ZNF354A复合物抑制包括ZDHHC20在内的抗氧化基因表达。当脂质过氧化物积累时，通过p38/JNK激酶磷酸化复合物关键组分，导致其解离和ZNF354A从染色质上释放，从而激活广泛的抗氧化和细胞保护程序。同时，被诱导表达的ZDHHC20L通过增强GPX4的S-酰化修饰，进一步提升细胞的脂质过氧化解毒能力。

这项研究的意义重大。它不仅揭示了一个全新的、表观遗传调控的氧化应激防御通路，深化了我们对细胞如何感知和响应脂质损伤的理解，而且为干预多种疾病提供了新的思路。例如，在癌症治疗中，抑制LORD通路可能使肿瘤细胞对铁死亡诱导疗法更敏感；而在神经退行性疾病或衰老过程中，激活LORD通路则可能有助于保护细胞免受氧化损伤。该通路的核心组件，如ZNF354A或其磷酸化状态，有望成为预测疾病进展和治疗反应的新型生物标志物。此外，研究揭示了ATF2这一经典转录激活因子在表观遗传抑制复合物中的非经典功能，以及KZFP蛋白在调控应激反应中的核心作用，为表观遗传学领域开辟了新的研究方向。总之，LORD通路的发现是氧化应激与铁死亡研究领域的一个里程碑，具有深远的科学价值和潜在的治疗前景。