β-抑制蛋白在GPCR内化中的多面性角色：从全局筛选到GLP-1R机制的新见解

《Nature Communications》：Multi-faceted roles of β-arrestins in G protein-coupled receptor endocytosis

本研究针对G蛋白偶联受体(GPCR)内化机制中β-抑制蛋白(β-arrestin)作用的传统认知局限，系统性地评估了60种GPCR的内化特性。研究人员发现β-arrestin仅对部分GPCR的内化至关重要，并深入揭示了GLP-1受体(GLP-1R)存在不依赖于β-arrestin、由AP2直接介导的内化新机制。该研究修正了GPCR内化的经典理论，为靶向GPCR信号转导的时空调控提供了新的治疗策略。

　　

在细胞通信的复杂世界中，G蛋白偶联受体(GPCR)家族扮演着至关重要的角色，它们如同细胞表面的天线，接收来自激素、神经递质等各种外部信号，进而调控细胞内的一系列生理过程。为了维持细胞对外界刺激反应的精确性，GPCR的活性受到严格调控，其中受体脱敏和内化（即受体从细胞膜表面转移到细胞内部的过程）是关键的负反馈机制。传统观点认为，这一过程主要由β-抑制蛋白(β-arrestin, Barr)所驱动：当GPCR被激活后，G蛋白偶联受体激酶(GRK)会磷酸化受体，进而招募Barr；Barr不仅能阻断G蛋白信号，还能作为支架蛋白，将受体引导至网格蛋白包被小窝(CCP)，通过网格蛋白适配蛋白复合物2(AP2)等组件完成内化。此外，内化后的受体还可能启动新的细胞内信号。因此，GPCR内化的失调与糖尿病、肥胖、癫痫等多种疾病密切相关。

然而，这一经典模型正面临挑战。越来越多的证据表明，并非所有GPCR的内化都完全依赖于Barr。例如，治疗2型糖尿病(T2D)和肥胖的关键靶点——胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)，其内化过程似乎存在Barr非依赖的途径，但具体机制尚不清晰。同时，Barr存在两种亚型（Barr1和Barr2），它们在不同细胞中的表达水平各异，其对不同GPCR内化的贡献是否存在差异，以及GPCR内化的全景图究竟如何，这些都是领域内亟待解决的重要问题。

为了回答这些问题，由Junke Liu和Li Xue等人领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们系统性地分析了60种人类GPCR的内化对Barr的依赖性，并选取GLP-1R作为模型，深入揭示了其独特的内化机制。研究发现，Barrs并非所有GPCR内化所必需，GLP-1R主要通过其C末端一段特定基序直接招募AP2来实现Barr非依赖的内化，而Barrs和GRKs在此过程中起到辅助和调控作用。这项研究极大地拓展了我们对GPCR内化机制的理解，揭示了其背后存在的多样性和复杂性。

研究人员为完成这项研究，主要运用了几项关键技术：首先，他们利用时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)技术，精确量化了不同细胞系中内源性Barr1和Barr2的表达水平。其次，他们广泛采用了扩散增强共振能量转移(DERET)内化测定法，实时、高通量地监测了60种GPCR在Barr1/Barr2双敲除(ΔBarr1/2)的HEK293细胞中，以及在外源性补充Barr1或Barr2情况下的激动剂诱导内化动力学。此外，研究团队还开发了多种创新的TR-FRET分子相互作用检测方法，用以在接近生理的条件下研究GLP-1R与Barr2、AP2之间的招募和相互作用。关键的遗传学工具包括Barr1/Barr2双敲除HEK293细胞系和GRK2/3/5/6四敲除(ΔGRK2/3/5/6)HEK293细胞系。研究还结合了计算机模拟，使用AlphaFold 3预测蛋白质复合物结构，并通过分子动力学(MD)模拟评估其稳定性。最后，他们还在更接近生理状态的小鼠胰腺β细胞模型中对GLP-1R的内化进行了验证。

研究结果

不同细胞系中内源性Barrs的表达模式

研究伊始，团队首先量化了Barrs在不同细胞背景下的表达。通过人类蛋白质组图谱数据库和自行开发的TR-FRET检测法，他们发现Barr1和Barr2的表达水平在不同组织和细胞系间存在显著差异。特别是在常用的HEK293和Hep G2细胞中，Barr1在Hep G2细胞中表达更高，而Barr2则在HEK293细胞中占优势。这种表达差异直接影响了GPCR的内化：在HEK293细胞中，敲低Barr2会显著抑制模型受体（如V2R、M2R）的内化，而敲低Barr1影响不大；但在Hep G2细胞中，敲低任一Barr亚型都会产生类似的抑制效果。这表明Barrs对GPCR内化的贡献受到细胞背景的显著影响，尤其是在Barr1高表达的细胞中，其作用不容忽视。

Barrs在GPCR内化中的重要性

为了在无Barr背景干扰下清晰评估其个体作用，研究团队在ΔBarr1/2 HEK293细胞中，系统分析了60种GPCR的激动剂诱导内化。根据内化行为对Barrs的依赖程度，这些受体被分为四类：(1) 无内化组（9种），即使在Barrs过表达下也无明显内化；(2) Barrs完全依赖组（28种），其内化严格依赖于外源性补充的Barr1或Barr2；(3) Barrs部分依赖组（多数），在无Barrs时有基础内化，但Barrs过表达能增强内化；(4) Barrs非依赖组（少数，如PAR1、VPAC1/2和GLP-1R），其内化在无Barrs时已很充分，Barrs过表达无进一步增强。值得注意的是，所有受试GPCR都表现出Barr非依赖的组成型内化（即无激动剂刺激下的基础内化），提示组成型内化可能存在一个普遍且不依赖于Barrs的机制。

Barrs并非GLP-1R内化所必需

研究聚焦于Barr非依赖内化的典型代表GLP-1R。在ΔBarr1/2细胞中，GLP-1R的激动剂（exendin-4）诱导的内化动力学和剂量反应曲线不受外源性表达Barr1或Barr2的影响。相反，作为Barr完全依赖对照的μ-阿片受体(MOR)，其内化则完全依赖于Barrs的补充。在亲本HEK293细胞中敲低Barrs，或在来自Barr2敲除小鼠的胰腺β细胞中，GLP-1R的内化均未受显著影响。使用barbadin（一种选择性抑制Barr与AP2相互作用的化合物）处理，也不能阻断GLP-1R的内化。这些结果从多个层面证实了GLP-1R内化的Barr非依赖性。然而，通过创新的TR-FRET实验，研究人员发现GLP-1R确实能够招募内源性Barr2，并能诱导Barr2与AP2复合物的形成。这说明GLP-1R具备与Barrs相互作用的能力，但其内化可以不依赖于此。

GLP-1R的C末端区域负责其Barr非依赖性内化

为了探寻GLP-1R实现Barr非依赖内化的分子基础，研究人员构建了系列嵌合体受体。他们将GLP-1R的C末端(CTD)替换为MOR、M2R等Barr依赖型受体的CTD，发现嵌合体（如GLP-1R_MOR）的内化转变为Barr部分依赖。反之，将Barr依赖型受体（如MOR、M2R）的CTD替换为GLP-1R的CTD后，嵌合体（如MOR_GLP）的内化则转变为Barr非依赖。这些实验清晰地表明，GPCR的C末端是决定其内化是否依赖Barrs的主要分子决定簇。

GLP-1R近端CTD中内化的关键决定因素

通过对GLP-1R CTD进行逐段缺失和定点突变，研究人员将介导内化的关键区域锁定在440-445位氨基酸（TSSLSS基序）。突变该基序（如6A突变体）会严重损害GLP-1R的内化，而突变远端可能的磷酸化位点（如4A突变体）则影响不大。这表明近端CTD的特定序列，而非传统的磷酸化模式，对GLP-1R的Barr非依赖内化至关重要。

AP2介导GLP-1R的激动剂诱导内化

机制探索表明，小窝蛋白(caveolin)或ARF6的敲低对GLP-1R内化无影响，但敲低AP2的μ2亚基则能显著抑制其内化，尤其在ΔBarr1/2细胞中抑制效果更强。这提示AP2是GLP-1R内化的关键适配器，并且在缺乏Barrs时更为重要。利用TR-FRET实验，他们直接观察到激动剂刺激后，GLP-1R能招募内源性AP2，且这一过程依赖于完整的TSSLSS基序，并可在ΔBarr1/2细胞中发生，证实了Barr非依赖的AP2招募。

Barrs促进AP2向GLP-1R的招募

尽管GLP-1R内化不依赖Barrs，但Barrs过表达能增强AP2的招募和内化效率。对于AP2结合受损的6A突变体，Barrs的过表达可以部分恢复其AP2招募和内化。然而，对于Barr结合受损的4A突变体，Barrs的过表达则无此效果。同时破坏AP2和Barr结合位点的10A突变体，则完全丧失了招募AP2和Barrs的能力。计算机模拟（AlphaFold 3和MD模拟）为GLP-1R CTD直接与AP2 μ亚基相互作用，以及其与Barr2 N结构域结合提供了结构模型支持。这些结果勾勒出一幅图景：GLP-1R主要通过直接与AP2相互作用内化（主要途径），而Barrs可以作为一种备份机制，通过同时结合受体和AP2来稳定复合物，从而促进内化。

GRK介导的AP2和Barr在GLP-1R内化过程中的招募

在ΔGRK2/3/5/6细胞中，GLP-1R对AP2和Barr2的招募及其内化均被大幅削弱，但并未完全消失。重新引入任一种GRK均可恢复这些过程。这表明GRKs对上述Barr依赖和非依赖的内化途径都至关重要，但同时存在一条GRK非依赖的内化途径。

AP2结合基序中GLP-1R遗传变体的内化受Barrs青睐

对GLP-1R天然遗传变体的分析发现，位于AP2结合基序内的T440A和S445T突变会损害受体内化，但这种缺陷可以通过过表达Barrs来弥补。这提示在AP2直接内化途径受损时，Barr依赖途径可以起到补偿作用，可能解释了某些变异个体为何未表现出相关疾病。

研究结论与意义

本研究通过对60种GPCR的大规模系统性分析，修正了GPCR内化的经典范式。研究揭示，Barrs仅在约三分之一的GPCR激动剂诱导内化中完全必需，而相当一部分GPCR拥有Barr非依赖或部分依赖的内化机制。以GLP-1R为模型，研究阐明了其存在多重内化途径：一条是不依赖Barrs、由受体CTD直接招募AP2的主要途径；一条是Barrs辅助的备份途径；还有一条是GRK非依赖的替代途径。这些途径共同确保了GLP-1R内化调控的精确性和鲁棒性。

该研究的深刻意义在于：首先，它揭示了GPCR内化机制的多样性和复杂性，强调了对每个GPCR进行具体分析的必要性。其次，它发现了GPCR直接与AP2相互作用的新颖非经典基序（TSSLSS），拓展了我们对网格蛋白介导内化机制的认识。最后，这些发现为药物研发开辟了新视角。通过特异性调控某条内化途径而非完全阻断内化，可能更精确地控制GPCR在时空上的信号输出，从而开发出副作用更小、疗效更佳的新型疗法，特别是在糖尿病、肥胖、神经系统疾病等GPCR相关疾病的治疗领域具有广阔的应用前景。