热力学原理揭示KLF1转录因子体外亲和力与细胞内单分子染色质状态的定量关联

《Cell》：Thermodynamic principles link in vitro transcription factor affinities to single-molecule chromatin states in cells

本研究针对转录因子(TF)结合动力学与染色质可及性形成的分子机制尚不明确的难题，通过整合高通量体外TF结合亲和力测量、细胞内单分子足迹图谱(SMF)及深度学习模型，系统解析了人源KLF1的DNA识别规律。研究发现，KLF1结合亲和力主要由基序识别概率而非结合时间驱动，侧翼序列可通过直接接触及调控TF搜索动力学显著调节结合能力，且体外测得的分钟级驻留时间与细胞内观测结果一致。进一步构建的热力学模型成功预测了不同基序语法下的染色质状态，首次实现了从体外参数定量推断体内TF占据与核小体排布规律，为基因调控的物理原理提供了突破性框架。

　　

在真核生物中，转录因子如何特异性识别DNA序列并驱动染色质开放，一直是基因调控研究的核心问题。尽管已知转录因子通过结合特定DNA基序发挥功能，但其在细胞内的实际占据率远低于体外预测，且不同基因组位点的结合强度差异巨大。这种差异究竟源于TF结合动力学的细胞环境依赖性，还是DNA序列上下文的隐性调控规则？针对这一难题，斯坦福大学与斯德哥尔摩大学联合团队以人源红细胞特异性KLF1为模型，通过跨尺度实验与建模，揭示了TF结合的热力学本质。

研究团队主要采用四种关键技术：高通量测序-荧光配体互作谱(HiTS-FLIP)定量KLF1与上万种DNA序列的结合动力学；单分子足迹技术(SMF)在K562细胞内原位观测TF与核小体的单分子分布；生物层干涉技术(Octet)验证关键结合参数；以及基于BPNet/ChromBPNet的深度学习模型解析序列语法规则。

KLF1结合亲和力由基序识别概率主导

通过HiTS-FLIP测量KLF1与包含基序突变及侧翼序列变异的DNA库的结合过程，发现关联速率(k_a)与解离速率(k_d)呈反相关关系，符合三态动力学模型：TF从溶液结合至DNA非特异性“测试态”后，以概率p_tot决定是否进入特异性结合。竞争实验表明，基序突变主要影响p_tot，而微观解离速率(k_off,μ)保持稳定，证明亲和力差异源于识别概率而非结合持续时间。

侧翼序列通过直接接触与搜索动力学调控亲和力

扩展位置权重矩阵(PWM)分析显示，基序侧翼10 bp序列可解释约40倍的亲和力变化，其中紧邻基序的-1、-2位点贡献最大（偏好鸟嘌呤），可能与KLF1非经典结合模式中的直接接触相关。更值得注意的是，远端侧翼（如基序一侧螺旋周期10.5 bp处）的GC含量与亲和力呈负相关，且周期性波动显著。通过建立TF搜索模型（结合滑移与跳跃扩散）的模拟验证，表明高GC或“类基序”序列会降低跳跃概率，从而减少TF抵达核心基序的机会。

细胞内KLF驻留时间与体外结果一致

利用SMF时间梯度实验（甲基化时长2-15分钟）观测基因组整合的KLF基序阵列，发现随着甲基化时间延长，基序保护信号逐渐消失，符合TF解离模型。拟合后得到KLF在细胞内的驻留时间为1.8分钟，与体外测量的1.4分钟高度一致。对照实验表明，快速解离的STAT3（约8秒）无法形成足迹，而慢速解离的CTCF则全程保持保护，证实该方法可准确捕获分钟级动力学过程。

热力学模型解析基序语法对染色质状态的调控

基于统计力学配分函数构建的模型显示，KLF结合在细胞内呈现非线性协同性：当基序数量低于3时几乎无结合，超过5个时核小体被完全排挤。这种阈值效应可通过“核小体去稳定化”模型（假设TF招募染色质重塑因子）而非蛋白质互作模型更好解释。进一步预测并验证了基序间距增大（15 bp→40 bp）会降低TF占据率，原因在于稀疏基序需消耗更多能量驱逐核小体。

体外参数预测体内结合规律

通过BPNet模型对KLF1 ChIP序列进行反卷积，得到的PWM权重与体外测量高度吻合（核心基序r²=0.90，侧翼序列r²=0.74）。将扩展PWM与热力学模型耦合后，仅凭序列信息即可准确预测SMF实验中不同侧翼序列下的TF与核小体占据状态（r=0.51–0.88），证明体外参数具备跨系统预测能力。

结论与展望

本研究首次建立了从TF-DNA微观结合参数到宏观染色质状态的定量预测框架，挑战了“TF结合仅由基序决定”的传统认知，揭示侧翼序列通过直接接触与搜索动力学双重机制调控亲和力。分钟级驻留时间的确认修正了哺乳动物TF结合为秒级瞬态作用的观点，为理解转录爆发等下游事件提供新线索。所开发的热力学模型以极少参数实现复杂染色质状态的准确预测，凸显生物物理原理在基因调控中的普适性，为合成生物学元件设计及疾病相关非编码突变解读奠定基础。