逆转Leloir途径实现葡萄糖直接合成半乳糖及塔格糖的生物合成新策略

《Cell Reports Physical Science》：Reversal of the Leloir pathway to promote galactose and tagatose synthesis from glucose

本刊推荐：为解决D-塔格糖生产依赖乳糖原料、碳损失严重的问题，Love等人通过逆转Leloir途径，在大肠杆菌中实现了葡萄糖直接向D-塔格糖的转化。研究关键发现了一种对半乳糖-1-磷酸具有高度特异性的磷酸酶（DdGal1Pase），通过计算模拟揭示了其底物选择性的结构基础。该工作为稀有糖的可持续生产提供了新范式。

　　

在健康饮食需求日益增长的今天，低热量天然甜味剂的开发成为食品工业的重要方向。D-塔格糖（D-tagatose）作为一种稀有糖，具有92%蔗糖甜度却仅含三分之一热量，被美国FDA认定为GRAS（一般公认安全）物质，是理想的蔗糖替代品。然而，塔格糖的自然丰度极低，传统化学合成法存在纯化困难、副产物多等问题，而生物制造方法又面临原料限制——当前主要依赖乳糖水解获得的半乳糖进行异构化，导致50%的碳损失（葡萄糖未被利用），严重制约了其经济可行性。

为解决这一瓶颈，发表在《Cell Reports Physical Science》的最新研究提出了一种颠覆性的解决方案：通过逆转天然半乳糖代谢的Leloir途径，实现从廉价葡萄糖直接合成塔格糖。该研究的创新点在于发现了一种关键酶——源自网柄菌（Dictyostelium discoideum）的半乳糖-1-磷酸特异性磷酸酶（DdGal1Pase），其能够驱动代谢流向逆向进行，克服途径热力学平衡限制。

研究团队采用多学科交叉方法，包括酶学筛选、代谢工程、结构生物学模拟及计算生物学。关键实验技术涵盖：① 系统发育分析指导下的磷酸酶异源表达与底物特异性筛选；② 大肠杆菌染色体编辑（Δpgi, ΔgalKM）与途径基因整合（pgm, BcLAI, DdGal1Pase）；③ 液相色谱-质谱联用（LC-MS）定量代谢物；④ 阿尔法折叠（AlphaFold）结构预测与分子动力学（MD）模拟；⑤ 量子力学/分子力学（QM/MM）计算揭示催化机制；⑥ 基于代谢动力学的转运蛋白工程（ΔydeA突变体构建）。

研究结果

A screen for Gal1P-specific phosphatases identifies a previously uncharacterized enzyme from slime mold

通过筛选9种系统发育多样的磷酸酶，发现唯一具有显著Gal1P活性的DdGal1Pase。该酶对Gal1P的活性显著高于对照（p=0.031），而对结构相似的G1P（葡萄糖-1-磷酸）或G6P（葡萄糖-6-磷酸）无特异性活性，首次实现C4差向异构体（半乳糖与葡萄糖）的精确区分。

DdGal1Pase substrate specificity drives reversal of the Leloir pathway

在ΔgalKMΔpgi:pgm工程菌株中，DdGal1Pase与凝结芽孢杆菌L-阿拉伯糖异构酶（BcLAI）共表达时，可从30 g/L葡萄糖产生8.7 g/L半乳糖和1.4 g/L塔格糖。通过调控DdGal1Pase的核糖体结合位点（RBS）强度，证实其表达水平与塔格糖产量呈剂量依赖性（图3C），且是途径限速关键。

Molecular simulations indicate that subtle interactions control DdGal1Pase substrate specificity

结构模拟显示DdGal1Pase属于肌醇单磷酸酶（IMPase）家族，活性中心含三个Mg²⁺离子。氢键分析表明，Gal1P的轴向C4-OH与E213形成稳定相互作用，而G1P的 equatorial C4-OH则导致其吡喃环倾斜24.4°，破坏催化几何构象（图5A-B）。QM/MM计算进一步揭示Gal1P水解的活化自由能（21.4 kcal·mol^-1）显著低于G1P（34.0 kcal·mol^-1）。

Metadynamics reveals distinct energy minima favoring Gal1P specificity

Well-tempered metadynamics模拟表明，Gal1P与D220（6OH）和D93（2OH）的氢键 occupancy 存在显著差异（ANOVA p=0.030/0.034），诱导拟合构象使Gal1P的2OH-G94、4OH-E213、6OH-D220形成稳定网络，而G1P则因D93-2OH优势结合导致催化残基失配（图6E-F）。

讨论与结论

本研究通过逆向重构Leloir途径，实现了从葡萄糖到塔格糖的一步式生物转化，理论产率提升至94.9%（较乳糖路线提高近一倍）。DdGal1Pase的底物特异性是途径成功的关键，其分子机制由活性中心氢键网络与金属离子协同作用决定。尽管当前塔格糖产量（>1 g/L）仍受限于半乳糖-塔格糖异构化平衡，但通过温度调控（50-60°C）和转运蛋白工程（ΔydeA突变体提升1.66倍产量）证明了优化潜力。该策略不仅为塔格糖的葡萄糖基生物制造奠定基础，更为其他半乳糖衍生分子（如乳寡糖）的合成提供了新平台，凸显了计算生物学驱动酶设计在代谢工程中的重要作用。